章 寶，單 楊，2，*，李高陽，2

（1.中南大學隆平分院，湖南長沙 410125；2.湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長沙 410125）

響應面優(yōu)化花生分離蛋白提取工藝的研究

章 寶1，單 楊1，2，*，李高陽1，2

（1.中南大學隆平分院，湖南長沙 410125；2.湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長沙 410125）

采用堿提酸沉法從低變性花生粕中提取花生分離蛋白，以花生分離蛋白提取率為響應值，應用Box-Behnken Design（BBD）對堿提溫度、時間、pH和液料比4因素進行響應面分析，確定堿提的最佳工藝條件為：堿提溫度57.5℃、時間100min、pH9.2和液料比12∶1；通過單因素實驗確定最佳酸沉pH為4.5。在此條件下，花生分離蛋白最高提取率為87.57%，與預測值87.88%相對誤差約為0.4%。

堿提酸沉，響應面法，分離蛋白，氨基酸

花生除直接食用外，主要用于榨油。我國每年可產(chǎn)生125萬t的花生餅粕[1]，花生餅粕含蛋白質50%左右，其中10%為清蛋白，90%為堿性蛋白，花生蛋白生物價（BV）為58，蛋白質效率比值（PER）為1.7，比面粉和玉米高[2-3]。在植物蛋白資源中，花生蛋白居第三位，占蛋白總量的11%，是較理想的食用蛋白資源[4]。與大豆蛋白相比，具有含腸胃脹氣因子和抗營養(yǎng)因子較少的優(yōu)點[5]；與菜籽、棉籽蛋白相比，具有所含毒性物質較少的優(yōu)點。影響花生分離蛋白提取率的因素很多，如提取溫度、時間、pH、液料比等?；ㄉ蛛x蛋白提取工藝的優(yōu)化，多數(shù)采用正交實驗方法，鮮有見到響應面法在這方面的研究報道。響應面法是一種優(yōu)化反應條件和加工工藝參數(shù)的有效方法，廣泛應用于化學化工、生物工程和食品工業(yè)等方面[6]。與正交實驗設計相比，響應面具有實驗周期短，回歸方程精度高，能同時研究幾種因素交互作用等優(yōu)點。目前，高純度花生蛋白的制備技術并不成熟，極大地限制了花生蛋白的應用范圍。作為一種經(jīng)典分離蛋白質的方法，堿提酸沉法可以用于高純度花生蛋白的制取[7]。本文對堿提酸沉法制備花生分離蛋白的條件進行了優(yōu)化研究，以期獲得更高的得率，提高操作穩(wěn)定性，為工業(yè)化生產(chǎn)提供有效技術參數(shù)。

1 材料與方法

1.1材料與設備

花生粕 實驗室超臨界CO2制備，低變性脫脂花生粕粉碎后過100目篩，總蛋白54.88%、灰分3.83%、脂肪2.06%、水分5.53%；氫氧化鈉、鹽酸 北京金輝通業(yè)化工有限公司，分析純。

Foss Kjeltec 2300全自動凱氏定氮儀 福斯中國有限公司；電子天平 FA1104型，上海燕恒實業(yè)有限公司；JJ-150W電子恒速攪拌器 上海比朗儀器有限公司；HJ9025型pH計 上海器宏科學儀器設備有限公司；水浴鍋 XMT-DA數(shù)顯調(diào)節(jié)儀，余姚市亞顯儀器儀表有限公司；DS-1高速組織搗碎機 江蘇金城國勝實驗儀器廠；TGL-20M臺式高速離心機 上海恒科有限公司；日立L-8900全自動氨基酸分析儀 江蘇同生科技有限公司；PH-1500小型高速噴霧干燥器 上海高機生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生分離蛋白提取工藝流程

1.2.2 檢測方法 蛋白質：GB 5009.5-2010；水分：GB 5009.3-2010；脂肪：GB/T 5512-2008；灰分：GB 5009.4-2010；氨基酸分析[8]：采用日立L-8900全自動氨基酸分析儀進行測定分析。

1.2.3 單因素實驗 對影響花生分離蛋白提取率的液料比、堿提溫度、堿提時間和pH 4個因素進行單因素實驗，并確定各因素響應面實驗取值范圍。提取率按下式計算：

1.2.4 響應面實驗設計 根據(jù)單因素實驗結果，采用Box-Behnken 4因素3水平的響應面（RSM），以堿提溫度、時間、液料比和pH為實驗因素（自變量），以花生分離蛋白的提取率為評價指標（響應值），分別進行二次多項回歸方程擬合及優(yōu)化分析。實驗設計因素及水平見表1。

表1 響應面實驗設計因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design factors

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 堿提時間對花生分離蛋白提取率的影響 在堿提pH9.0，液料比為10∶1，堿提溫度50℃，堿提2次的條件下，考察不同浸提時間（0.5、1、1.5、2、2.5h）對花生分離蛋白提取率的影響，結果見圖1。

由圖1可知，在堿提時間小于1.5h時，分離蛋白提取率隨著堿提時間的增加而增加，當時間大于1.5h時，分離蛋白的提取率隨著時間的延長無明顯變化。即時間達到1.5h時，蛋白的溶出率已達到動態(tài)平衡。因此，從節(jié)省時間和能耗的角度考慮，選擇1.5h為最佳堿提時間。

圖1 堿提時間對花生分離蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on peanut protein isolate yield

2.1.2 堿提pH對花生分離蛋白提取率的影響 在液料比為10∶1，堿提溫度50℃，堿提2次，每次1.5h的條件下，考察不同堿提pH（7.5，8.0，8.5，9.0，9.5）對花生分離蛋白提取率的影響，結果見圖2。

由圖2可以看出，堿提pH對分離蛋白提取率有很大影響，pH小于8時，花生分離蛋白的提取率的增加緩慢，pH在8～9時，隨著pH的增加，分離蛋白提取率增加迅速，當pH大于9時，花生分離蛋白的提取率變化不明顯，并且隨著pH的升高提取液粘度增加，不利于下一步的離心分離過程；另外，加入過多的堿會使花生分離蛋白口感帶有咸苦味，從而限制花生分離蛋白的進一步利用[9]。而且堿性太強還會引起脫氨、脫羧和肽鍵斷裂，引起胱賴反應，將氨基酸轉變?yōu)橛卸净衔颷10]。故初步確定堿提pH為9.0。

圖2 堿提pH對花生分離蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of extraction pH on peanut protein isolate yield

2.1.3 堿提溫度對花生分離蛋白提取率的影響 在液料比為10∶1，堿提pH9.0，堿提2次，每次1.5h的條件下，考察不同堿提溫度（30、40、50、60、70℃）對花生分離蛋白提取率的影響，結果見圖3。

圖3 堿提溫度對花生分離蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on peanut protein isolate yield

由圖3可以看出，當溫度小于60℃時，隨著溫度的升高，分離蛋白的提取率隨之增加，但當溫度大于60℃后，蛋白的提取率反而下降。主要原因是溫度高于65℃時蛋白質開始變性，溫度高于80℃時，蛋白質會形成凝膠，所以堿提溫度過高，不僅會使蛋白變性，影響其功能性，而且粘度增加，分離困難，分離能耗提高[11]。初步確定堿提溫度為60℃。

2.1.4 液料比對花生分離蛋白提取率的影響 在堿提pH9.0，堿提溫度50℃，堿提2次，每次1.5h的條件下，考察不同液料比（5∶1，10∶1，15∶1，20∶1）對花生分離蛋白提取率的影響，結果見圖4。

圖4 液料比對花生分離蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of ratio of liquid and material on peanut protein isolate yield

由圖4可知，液料比小于10∶1時，隨液料比的增加，分離蛋白的提取率有所增加，但當液料比大于10∶1后，分離蛋白的提取率隨液料比的增加無明顯變化。當液料比達到10∶1時，蛋白的溶出率已達到動態(tài)平衡，初步確定液料比為10∶1。

2.2 響應面實驗結果與分析

對以上4個單因素使用Design-Expert 8.0.1軟件設計4因素3水平共29個實驗（5個中心點）響應面分析實驗。這29個實驗分為兩類：其中24個析因點為自變量取值在各因素所構成三位頂點，零點為區(qū)域中心點，重復5次，用于估計實驗誤差。

2.2.1 實驗結果 響應面實驗結果見表2。

2.2.2 模型建立及顯著性檢驗 對表2實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到花生蛋白提取率（Y）對堿提溫度（X1）、堿提時間（X2）、液料比（X3）和堿提pH（X4）二次多項回歸模型為：

對該模型進行顯著性檢驗，結果見表3。

由表3可知，模型P＜0.0001，說明該模型高度顯著，失擬項P=0.0535＞0.05，說明該模型失擬項不顯著，復相關系數(shù)R2=0.9913，Radj2=0.9827，說明該方程對實驗擬合好，實驗誤差??；信噪比Adeq Precision=33.949＞4，說明該模型可得到足夠強相應信號，因此可以用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析和預測。由表4可看出，模型一次項X2、X3、X4高度顯著，X1顯著；交互項X1X2高度顯著，X1X4、X2X3影響顯著，其他交互項不顯著；二次項X12、X22、X32、X42影響也高度顯著。表明各影響因素對花生分離蛋白提取率的影響不是簡單的線性關系。通過直接比較方程中一次項系數(shù)絕對值的大小來判斷因素影響的主次性，對花生分離蛋白提取率影響因素由大到小依次是：X3＞X4＞X2＞X1，即液料比＞pH＞時間＞溫度。

表2 Box-Behnken模型實驗設計方案及實驗結果Table 2 Box-Behnken experimental design and model test results

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.3 提取工藝的響應面分析與優(yōu)化 響應面的圖形是響應值對各實驗因素的值所構成的一個三維空間在二維平面上的等高圖[12]。響應面曲線較陡，表明影響因子的影響較為顯著，響應值變化較大；曲線較為平滑，表明影響因子的影響較小，響應值變化較小。由圖5可看出，X1、X2交互作用高度顯著，X1、X4和X2、X3交互作用顯著，其他交互項不顯著。根據(jù)響應面分析得到的最佳工藝參數(shù)：堿提溫度57.41℃，時間1.67h，液料比12.14∶1，pH9.22。在此條件下，花生分離蛋白的提取率的理論預測值為87.88%。

考慮到實際操作的局限性，故將實際提取工藝條件修正為堿提溫度57.5℃、時間100min、液料比12∶1、pH9.2，在修正條件下進行3次重復驗證實驗，分離蛋白的提取率平均值達到87.57%，與理論值相對誤差約為0.4%。此條件下制備的花生分離蛋白的純度為94.58%。由此可見，響應面分析的優(yōu)化結果與實際值較吻合，且能獲得高純度花生分離蛋白，得到的提取工藝條件具有一定的應用價值。

表4 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結果Table 4 Regression coefficient significance test results

圖5 各兩因素交互作用對提取率影響的響應面圖Fig.5 Response surfaces plot showing the effects of temperature and time，temperature and ratio of liquid and material，temperature and pH，time and ratio of liquid and material，time and pH，and ratio of liquid and material and pH on extraction yield of peanut protein isolate

2.3 酸沉pH條件的確定

分別稱取5份10.0g花生粕，在堿提條件為溫度50℃、液料比10∶1、時間1.5h、pH9進行堿提，得到的堿提液于不同的pH（4.1，4.3，4.5，4.7，4.9）條件進行酸沉，測得分離蛋白的得率，重復實驗三次，結果見圖6。

由圖6可看出，花生分離蛋白提取率隨pH的升高，先增加后減少，在pH4.5時，分離蛋白的提取率達最大值，初步判定花生分離蛋白的等電點為pH4.5，故選擇pH4.5為最佳酸沉pH。

圖6 酸沉pH對花生分離蛋白提取率的影響Fig.6 Effect of acid precipitation pH on peanut protein isolate yield

2.4 低變性花生粕和花生分離蛋白的氨基酸含量比較

由表5可知，花生分離蛋白中共檢測到17種氨基酸，氨基酸總含量為93.63g/100g，而低變性花生粕的氨基酸含量僅為54.60%?；ㄉ蛛x蛋白中成人必需的7種氨基酸（色氨酸未測出）含量達24.99g/100g，占氨基酸總量的26.69%?；ㄉ蛛x蛋白中的17種氨基酸含量都超過了1g/100g，其中谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸的含量較高，均超過了10g/100g?；ㄉ蛛x蛋白必需氨基酸含量與FAO模式相比賴氨酸和蛋氨酸含量較低，而其他氨基酸成分含量較平衡。

3 結論

對花生分離蛋白堿提工藝條件進行了單因素和響應面優(yōu)化實驗。結果顯示液料比、pH及時間對花生分離蛋白提取率的影響極顯著，溫度的影響顯著，影響作用按主次順序排列為液料比＞pH＞時間＞溫度。確定最佳堿提溫度57.5℃，堿提2次，每次100min，堿提液料比為12∶1，堿提pH9.2。并對酸沉pH進行了單因素實驗，得到最佳酸沉pH為4.5。在此工藝條件下，制得花生分離蛋白產(chǎn)品得率最高可達87.57%。制備的花生分離蛋白的氨基酸種類及含量非常豐富，所含的17種氨基酸含量均超過1g/100g，其中谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸的含量較高，都超過了10g/100g，將其添加到其他谷物中，起到氨基酸互補作用，對開發(fā)營養(yǎng)保健品有著重要作用。

表5 花生蛋白氨基酸組成含量（g/100g）Table 5 Amino acid composition of peanut protein content

制備的花生分離蛋白的純度為94.58%，采用噴霧干燥可提高花生分離蛋白的組織狀態(tài)，進而改善其乳化性、持水性等相關的特性，使其能廣泛應用于肉制品、乳制品、焙烤食品及保健食品等。響應面優(yōu)化得到的花生分離蛋白提取工藝條件對實際生產(chǎn)具有重要的參考價值。

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Optimization of processing parameters for extraction of peanut protein isolate by response surface methodology

ZHANG Bao1，SHAN Yang1，2，*，LI Gao-yang1，2
（1.Longping Branch Graduate School，Central South University，Changsha 410125，China；2.Hunan Agricultural Product Processing Institute，Changsha 410125，China）

Peanut protein isolate was prepared through alkaline extraction and acid precipitation from low variability peanut meal.The optimal values of theoretical parameters including extraction temperature，ratio of liquid and material，extraction time and extraction pH were investigated by Box-Behnken surface response design method.The optimum conditions of alkaline extraction were as followed：extraction temperature 57.5℃，ratio of liquid to material 12 ∶1，extraction time 100min and pH 9.2.And based on the single-factor test，the optimum pH4.5 of acid precipitation was determined.Under these conditions，the maximum protein extraction rate of 87.57%was obtained.The relative error with predicted value was 0.4%.

alkali extraction and acid precipitation；response surface methodology；protein isolate；amino acid

TS201.1

B

1002-0306（2012）11-0270-05

2011－09－29 * 通訊聯(lián)系人

章寶（1986-），男，在讀研究生，研究方向：食品加工與綜合利用。

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（200903043）；湖南省產(chǎn)學研結合專項（2009XK6001）。