羅琥捷，區(qū)海燕，楊宜婷

(無限極(中國)有限公司，廣東廣州 510665)

功能食品中番茄紅素的高效液相色譜檢測方法

羅琥捷，區(qū)海燕，楊宜婷

(無限極(中國)有限公司，廣東廣州 510665)

建立了一種廣泛適用于功能食品的測定番茄紅素含量的高效液相色譜檢測方法。樣品前處理采用水油兩相萃取方法;色譜條件為色譜柱 Inertsil ODS－SP 柱(5μm，4.6 ×250mm)，流動相為乙腈∶甲醇 =1∶1，流速為 1.2mL/min，檢測波長為472nm。分析結(jié)果表明，番茄紅素在0.30～50.0μg/mL線性良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，加標(biāo)回收率98.6%，RSD為3.0%，說明該方法準(zhǔn)確可靠。

高效液相色譜法(HPLC)，番茄紅素，檢測

番茄紅素(Lycopene)是β－類胡蘿卜素的一種。目前研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗氧化、清除自由基、促進(jìn)細(xì)胞間的連接和傳導(dǎo)、防癌抗癌等多種生理功能。作為一種功能性的天然色素，番茄紅素被認(rèn)為可以廣泛利用在功能性食品和醫(yī)藥(原料)中［1］。功能食品的劑型很多，從形態(tài)上主要分成固體制劑和液體制劑。功能食品根據(jù)劑型的不同而選擇不同的番茄紅素原料，例如片劑和硬膠囊的固體制劑會選用固體的番茄紅素原料。由于番茄紅素的穩(wěn)定性差，固體番茄紅素原料多為微囊化包埋，而不同公司的微囊化包埋操作不一樣，這給番茄紅素含量的檢測帶來困難。GB/T 22249－2008［2］在針對某些國內(nèi)外微囊化包埋的番茄紅素的檢測就遇到了困難，前人的研究［3－4］也多圍繞番茄、番茄提取物等未經(jīng)微囊化包埋處理的物料進(jìn)行，這給現(xiàn)實(shí)的檢測工作帶來了不便。本實(shí)驗(yàn)建立了一種適用于含微囊化包埋處理的番茄紅素的功能食品的含量檢測方法，而且該方法也適用于市面上常見的油狀的含番茄紅素的功能食品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番茄紅素包埋粒 購于健永生技、DSM、華北制藥、浙江新昌等公司;含番茄紅素的固體功能食品自制(以下方法學(xué)研究，如無特殊交代，均選用了健永生技公司的番茄紅素);市售番茄紅素功能食品(GNC、楓之寶、家得路);番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品 購于Sigma公司，純度95%以上;二氯甲烷、丙酮、石油醚、焦性沒食子酸、2，6－二叔丁基對甲酚(BHT)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀均為分析純;乙腈、乙酸乙酯為色譜純;水為超純水。

1200型高效液相色譜儀 安捷倫公司;AL204型電子天平梅特勒－托利多公司;AS10200BDT超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯公司;XW－80A旋渦混合器 北京維欣儀器公司。

1.2 色譜條件［2］

流動相:乙腈∶甲醇 =1∶1;流速:1.2mL/min;色譜柱:Inertsil ODS－SP柱(5μm，4.6×250mm);檢測波長:472nm，柱溫:室溫;進(jìn)樣量10μL。

1.3 試液的配制(臨用新配制)［2］

0.1%BHT二氯甲烷溶液的配制:取0.50g BHT加入二氯甲烷500mL溶解，混勻。

0.1%BHT丙酮溶液的配制:取0.25g BHT加入丙酮250mL溶解，混勻。

磷酸鹽溶液的配制:取磷酸氫二鈉11.49g、磷酸二氫鉀0.41g，加水200mL，超聲溶解，混勻。

焦性沒食子酸磷酸鹽溶液的制備:取焦性沒食子酸適量，加以上磷酸鹽溶液制成每1mL約含1mg的溶液，即得。

1.4 對照品溶液的制備(臨用新配制)

對照品儲備溶液的制備:精密稱取0.01g番茄紅素對照品，加二氯甲烷約5mL超聲至完全溶解，冷卻，用0.1%BHT丙酮溶液定容至50mL。配制成濃度為200μg/mL的番茄紅素對照品儲備溶液。

對照品校準(zhǔn)溶液的標(biāo)定:吸取對照品儲備溶液0.1mL(V1)用石油醚定容至10mL(V2)，采用紫外/可見分光光度計(jì)，1cm比色皿，波長472nm測量對照品溶液吸光度值，石油醚作空白。按照下式計(jì)算對照品溶液番茄紅素的濃度CST(μg/mL)。

式中:A:對照品在472nm處的吸光系數(shù);104:1g/100mL轉(zhuǎn)化為 1μg/mL的轉(zhuǎn)換因子;3450:1g/100mL番茄紅素在石油醚中的理論吸光系數(shù)。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備:精密吸取該對照品儲備溶液 0.125、0.25、0.50、1.00、2.50mL 分別置 10mL 量瓶中，加入含0.1%BHT丙酮溶液稀釋至刻度，搖勻。

1.5 供試品溶液的制備

供試品溶液的制備:取4g樣品，混合均勻，取約0.38g，精密稱定，置250mL棕色容量瓶中，加入焦性沒食子酸磷酸鹽溶液70mL，再加入BHT二氯甲烷溶液100mL，渦旋混合2min，超聲處理(功率250W，頻率50kHz)30min，旋渦混勻，靜置5min，目測瓶底無明顯紅色番茄紅素細(xì)微顆粒(若有顆?？杉尤?mL甲苯再超聲 30min)，旋渦混勻 3～5min，離心(5500r/min)5min，分取二氯甲烷液，水液依次再加入BHT二氯甲烷溶液80、60mL，旋渦混旋均勻，離心分取二氯甲烷液，合并三次二氯甲烷液，加入BHT二氯甲烷溶液定容至250mL，搖勻，吸取此溶液2.00mL用0.1%BHT丙酮定容至10mL，即得。

1.6 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品貯備溶液 0.125、0.25、0.50、1.00、2.50mL分別置10mL量瓶中，加入含0.1%BHT丙酮溶液稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別含番茄紅素2.5、5.0、10.0、20.0、50.0μg/mL 系列溶液;再分別精密吸取10.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液0.30、1.25mL置10mL量瓶中，加入含0.1%BHT丙酮溶液稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別含番茄紅素0.300、1.25μg/mL溶液。把上述7種標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣測定峰面積響應(yīng)值(10.0μL進(jìn)樣)，分別以濃度 C(μg/mL)為橫坐標(biāo)和峰面積響應(yīng)值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，得回歸方程(Y為濃度值，X為峰面積)。

1.7 精密度實(shí)驗(yàn)

1.7.1 儀器精密度 取濃度為2.2μg/mL的番茄紅素對照品溶液一份，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.7.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取含番茄紅素的樣品6份，按1.5方法處理，精密吸取供試品溶液各10.0μL，注入液相色譜儀測定，計(jì)算平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.7.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取含番茄紅素的樣品，由3名操作人員分別在2d內(nèi)分別進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)操作按1.5方法進(jìn)行，精密吸取供試品溶液各10.0μL，注入液相色譜儀測定，計(jì)算平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取含番茄紅素的供試品溶液一份，測試開始，每隔1h，連續(xù)測定3次，然后每隔2h，連續(xù)測定3次，計(jì)算平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.9 加標(biāo)回收率的測定方法

轉(zhuǎn)身幫泥巴扣好了帶子。左小龍開著摩托車載著她走。當(dāng)時是春天。是春天的中旬，是一個獨(dú)立的氣候。陽光灑滿，云朵從云朵里穿透過來，空中的風(fēng)就像是裙子撩動的氣流，左小龍默默的載著泥巴到了一個垃圾站前。他把泥巴放下車，摘掉自己的頭盔，再取下泥巴的頭盔，問：“你是不是言情小說看多了？”

把含番茄紅素樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果作為本底值，取該番茄紅素樣品適量，分0.8、1.0、1.2倍三個濃度水平加入一定量的對照品，按1.5方法處理及測定，計(jì)算回收率、平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.10 檢測限與定量限的確定

根據(jù)方法學(xué)要求，以3倍信噪比作為儀器檢測限，10倍信噪比作為儀器定量限。

1.11 測量范圍考察取含番茄紅素樣品，稱取不同的樣品量，按1.5方法處理樣品，并使其測定濃度在線性范圍的低、中、較高、高處，以驗(yàn)證該方法測定不同番茄紅素含量的樣品的準(zhǔn)確性，計(jì)算平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.12 樣品測定

1.12.1 其它固體功能食品 選用其它公司的番茄紅素包埋粒自制功能食品，按1.5方法處理樣品并進(jìn)行含量檢測，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.12.2 市售番茄紅素功能食品 上市的含番茄紅素的功能食品中軟膠囊非常普遍，購買三款產(chǎn)品驗(yàn)證該番茄紅素檢測方法的適用性。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的確定

2.2 系統(tǒng)適用性

在確定的色譜條件下，番茄紅素保留時間分別為:12.83min，對稱因子為0.81，符合要求;理論塔板數(shù)以半峰寬法計(jì)算，為10141，符合要求。見圖1。

圖1 番茄紅素對照品色譜圖(上圖)和光譜圖(下圖)Fig.1 HPLC chromatogram(up)and spectrum(down of lycopene standards

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of the precision test

表3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the reproducibility test

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of the stability test

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立

結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)說明:標(biāo)準(zhǔn)濃度在0.30～50.0μg/mL 線性良好，R2=0.9998。

圖2 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of lycopene

2.4 精密度分析

2.4.1 儀器精密度分析 結(jié)果見表1。由表1可見，RSD為2.1%，說明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性分析 結(jié)果見表2。由表2可見，RSD為0.4%，說明方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)符合方法學(xué)要求。

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the repeatability test

2.4.3 重現(xiàn)性分析 結(jié)果見表3。由表3可見，RSD為0.7%，實(shí)驗(yàn)說明該方法的重現(xiàn)性好。

2.5 穩(wěn)定性分析

結(jié)果見表4。由表4可見，測定溶液在8h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.6 加標(biāo)回收率結(jié)果分析

結(jié)果見表5。由表5可見，該方法條件下，加標(biāo)回收測定結(jié)果好，平均回收率98.6%，而RSD僅為3.0%。因此，該色譜分析方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表5 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of the recovery test

2.7 檢測限與定量限的分析

一般情況下，以3倍信噪比作為儀器檢測限，10倍信噪比作為儀器定量限，按照本實(shí)驗(yàn)的儀器色譜條件，0.10μg/mL信噪比為3.8≥3，作為儀器檢測限，0.30μg/mL信噪比為11.8≥10，作為儀器定量限。

2.8 測量范圍的分析

結(jié)果如表6所示。由表6可見，該方法條件下，樣品測定結(jié)果的重復(fù)性好，相對偏差RSD為0.6%，說明該方法適用于不同濃度的番茄紅素含量的樣品。

表6 測定范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of the measuring range test

2.9 樣品的測定

2.9.1 不同番茄紅素包埋粒的自制食品的測定 結(jié)果如表7所示。

由表7可見，該方法適用于多種番茄紅素包埋粒做成的固體功能食品。目前，市面上越來越多廠家銷售番茄紅素包埋粒，其各自采用不同的水溶乳化體系進(jìn)行微囊化包埋生產(chǎn)。而本次實(shí)驗(yàn)所用到的國內(nèi)外四家公司的番茄紅素包埋粒其水溶性不盡相同，有的水溶，有的水難溶，所以該檢測方法對番茄紅素包埋粒適用范圍廣。

表7 其它樣品測定結(jié)果Table 7 Results of other samples

2.9.2 市售番茄紅素功能食品的測定 結(jié)果如表8所示。

由表8可見，該方法適用于多家市售番茄紅素的產(chǎn)品。番茄紅素軟膠囊內(nèi)容物基本上是以植物油為穩(wěn)定劑，再輔以功效成分而制成。在檢測前處理階段，主要是要充分萃取番茄紅素。該方法的前處理操作中既有水溶媒又有有機(jī)溶媒，這對處理難溶于水的番茄紅素而言就較為容易。所以可以推測該檢測方法適用于番茄紅素軟膠囊。

3 結(jié)論

雖然目前番茄紅素功能食品主要以軟膠囊為主，但是隨著番茄紅素包埋粒的推廣及普及，番茄紅素功能食品會越來越多出現(xiàn)固體制劑形式。本實(shí)驗(yàn)建立了一種廣譜的用HPLC方法測定方法。該方法選擇適宜的水油萃取體系、檢測波長、色譜柱溫、等度洗脫等參數(shù)，較好地實(shí)現(xiàn)了番茄紅素的分離，平均回收率達(dá)到98.6%，RSD為3.0%，說明該方法實(shí)用、準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好。

表8 其它樣品測定結(jié)果Table 8 Results of other samples

［1］劉立國，吳晶.番茄紅素及生產(chǎn)應(yīng)用研究［J］.食品工業(yè)科技，2002，23(4):74－75.

［2］楊大進(jìn)，魯杰，王竹天，等.GB/T 22249－2008保健食品中番茄紅素的測定［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

［3］張志強(qiáng)，江英.番茄紅素的HPLC檢測方法的研究［J］.四川食品與發(fā)酵，2006，42(6):44－46.

［4］郭戎，包貝華，邵霞，等.HPLC法測定番茄紅素提取物中番茄紅素的含量［J］.江蘇科技信息，2010(12):32－33.

Determination on lycopene in functional foods by the high performance liquid chromatographic method

LUO Hu－jie，OU Hai－yan，YANG Yi－ting
(Infinitus(China)Company Ltd.，Guangzhou 510665，China)

The content of lycopene in functional foodswas determined bythe high performance liquid chromatographic method(HPLC).The sample pre－treatment method was by use of water－oil two－phase extraction methods.Separation was achieved by the use of Inertsil ODS－SP column(5μm，4.6 × 250mm)，acetonitrile∶methanol(1∶1)as mobile phase，a flow rate of 1.2mL/min and detector at 472nm was used.Lycopene showed good linear relationship between the range of 0.30 and 50.0μg/mL(R2=0.9998);and the average recovery was 98.6%with RSD=3.0%.The results showed that the method was accurate.

high performance liquid chromatographic method(HPLC);lycopene;determination

TS207.3

A

1002－0306(2012)17－0299－04

2012－02－01

羅琥捷(1979－)，男，碩士，工程師，主要從事功能食品的開發(fā)研究。