武 洋

（平?jīng)鲠t(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，甘肅 平?jīng)?744000）

胡蘿卜素柱層析分離實(shí)驗(yàn)最佳材料的探究

武 洋

（平?jīng)鲠t(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，甘肅 平?jīng)?744000）

層析法是近代生物化學(xué)中應(yīng)用較為廣泛的物理化學(xué)分析方法之一，所以許多學(xué)校在生物化學(xué)課中開(kāi)設(shè)了吸附柱層析法分離胡蘿卜素實(shí)驗(yàn)。該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)用到的實(shí)驗(yàn)材料很多，如菠菜葉、胡蘿卜、紅辣椒等。研究發(fā)現(xiàn)，菠菜葉是胡蘿卜素柱層析分離實(shí)驗(yàn)的最佳材料，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定，每條色帶都很清晰。

胡蘿卜素柱層析分離實(shí)驗(yàn)；最佳材料；菠菜葉

1 層析法

1.1 層析法概述

層析法（Chromatography）是近代生物化學(xué)中應(yīng)用較為廣泛的物理化學(xué)分析方法之一。1906年俄國(guó)植物學(xué)家米哈伊爾·茨維特將此法用于植物色素的分離，故又稱(chēng)色層分析法，最初命名采用Chromatography這一詞來(lái)描述這一技術(shù)（源于希臘文Chromatos，顏色）[1]。

該法是利用混合物中各組分分子結(jié)構(gòu)互不相同，理化性質(zhì)（溶解度、吸附力、分子大小形狀及分子極性等）各異，因而在支持物（吸附劑）上分布于不同的區(qū)帶，以達(dá)到分離的目的。層析法一般利用兩個(gè)相，一個(gè)稱(chēng)固定相，一個(gè)稱(chēng)流動(dòng)相。目前常用的層析法根據(jù)分離原理不同而分為吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析和親和層析法等。其中吸附層析法又可根據(jù)操作形式的不同分為柱層析法和薄板層析法等[2]。

柱層析法是用一根玻璃柱（1 cm×16 cm）內(nèi)裝吸附劑粉末（MgO、Al2O3、硅膠等），在柱頂部加入要分離的樣品溶液，再加入一定的有機(jī)溶劑（流動(dòng)相）以洗脫樣品中各組分，由于吸附劑對(duì)各組分的吸附力不同及各組分在洗脫劑中的溶解度不同，因而在洗脫過(guò)程中各組分隨洗脫劑向下流動(dòng)時(shí)，層析柱中連續(xù)不斷地產(chǎn)生吸附、溶解（解吸附），再吸附、再解吸附的現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的吸附、解吸附后，樣品中各組分即以不同的速度向下移動(dòng)，逐漸分離，在柱上形成不同的區(qū)帶，先后從柱下端流出，分步收集，可供進(jìn)一步鑒定[3]。

1.2 研究的目的與意義

運(yùn)用層析法可分離性質(zhì)極為相似，而用一般化學(xué)方法難以分離的各種化合物[3]。為了讓學(xué)生了解柱層析分離法的基本原理及其在生物化學(xué)中的應(yīng)用，許多學(xué)校在生物化學(xué)課中開(kāi)設(shè)了此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。層析法的種類(lèi)很多，其中利用吸附柱層析法分離胡蘿卜素的實(shí)驗(yàn)以其所用儀器簡(jiǎn)單、材料便宜受到教師的青睞。該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)用到的材料很多，如菠菜葉、胡蘿卜、紅辣椒等，但每種材料所呈現(xiàn)的最終結(jié)果各不相同。到底哪一種材料的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為清晰、穩(wěn)定，能讓學(xué)生一目了然，是本次研究的目的。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與器材

2.1.1 材料 菠菜葉、胡蘿卜、紅辣椒（濕）。

2.1.2 器材 研缽、干燥層析柱、分液漏斗、干燥試管。

2.1.3 主要試劑 95%乙醇，石油醚，2%丙酮石油醚，輕質(zhì)MgO（干燥110℃～140℃烘烤 2～4 h，粉末狀），無(wú)水Na2SO4粉末（110℃烘烤）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 實(shí)驗(yàn)流程

2.2.2 實(shí)驗(yàn)技術(shù)要點(diǎn)（1）提取。取擦干的菠菜葉、紅辣椒、胡蘿卜各10 g分別置于3個(gè)研缽中，各加95%乙醇（起破碎細(xì)胞作用）10 ml進(jìn)行研磨，菠菜葉、紅辣椒和胡蘿卜研磨至糊狀，提取液顏色變深后，再各加石油醚19 ml進(jìn)行萃取[4]，研磨時(shí)輕輕攪拌，以防溶液乳化，研磨好后靜置一會(huì)。取出提取液（上清液），分別置分液漏斗中，緩慢加入1/2體積的蒸餾水洗滌，至水層透明為止（一般洗滌3次），以除去提取液中的乙醇。將3種提取液醚層分別倒入3個(gè)干燥試管中，加無(wú)水Na2SO4數(shù)克去除水分，加塞備用。此時(shí)，菠菜葉提取液為深綠色，紅辣椒和胡蘿卜提取液均為橘黃色。

（2）層析柱的制備。取3根1 cm×16 cm玻璃層析管，底部分別放少量棉花，然后裝入MgO粉末，用平頂玻璃棒輕輕壓緊，至粉末達(dá)8 cm高度，裝柱要均勻、無(wú)斷層，管中MgO粉末要水平。再于柱頂蓋以無(wú)水Na2SO40.5～1 cm，將柱垂直夾在鐵架上備用。

（3）層析。取3種提取液1 ml自柱頂沿管壁加入柱頂表面，待提取液全部進(jìn)入層析柱時(shí)，立即加入含2%丙酮的石油醚3 ml洗脫，使吸附在柱上的各組分逐漸展開(kāi)成為數(shù)條顏色不同的色帶。丙酮可增強(qiáng)洗脫效果，但含量不宜過(guò)高，以免洗脫過(guò)快，使色帶分離不清晰[5]。

（4）觀(guān)察色帶。2 min后對(duì)3根玻璃層析管中條帶進(jìn)行觀(guān)察。由于本實(shí)驗(yàn)只需觀(guān)察色帶展開(kāi)情況便可得到所要結(jié)果，是一個(gè)定性實(shí)驗(yàn)，不做定量，所以不進(jìn)行色素的收集工作。

3 結(jié)果與分析

3.1 理論結(jié)果

胡蘿卜素常與其他植物色素共存于綠葉蔬菜及紅辣椒、胡蘿卜中，可用乙醇、石油醚及丙酮等有機(jī)溶劑提取。當(dāng)其被MgO吸附時(shí)，由于它與其他植物色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，因此理化性質(zhì)不同，故可用層析法將其分離。最終色帶最下層為胡蘿卜素，其上依次為葉黃素、葉綠素a和葉綠素b。由于胡蘿卜素的分子量最小，在固定相中的吸附能力最弱，在洗脫劑中的溶解度最大，故在層析柱內(nèi)下移速度最快，分布在層析柱的最下端，最先被洗脫下來(lái)；葉黃素是胡蘿卜素的羥化物，分子量較胡蘿卜素大，吸附能力較強(qiáng)，在洗脫劑中的溶解度較小，所以條帶在胡蘿卜素的上方；再往上是葉綠素a；葉綠素b的分子量最大，吸附能力最強(qiáng)，在洗脫劑中的溶解度最小，所以在最上層。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3種材料實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 3種材料柱層析分離結(jié)果

從圖1可以看出：材料為菠菜葉時(shí)，各條色帶清晰，經(jīng)過(guò)幾次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果也很穩(wěn)定，每次均能看出4條清晰色帶，尤其是胡蘿卜素遠(yuǎn)遠(yuǎn)地被分離開(kāi)；材料為胡蘿卜和紅辣椒時(shí)，經(jīng)過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雖然胡蘿卜素含量很高，也能清晰地看到，但由于其他紅色的色素過(guò)多，與胡蘿卜素混在一起，影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不能使學(xué)生一目了然，同時(shí)其他色素含量較少，也不能清晰地看到。

4 結(jié)論

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，菠菜葉是胡蘿卜素柱層析分離實(shí)驗(yàn)的最佳材料，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定，每條色帶都很清晰，可以清楚地看到4條色帶（見(jiàn)圖2），從下至上依次為：胡蘿卜素（橘黃色）、葉黃素（金黃色）、葉綠素a（藍(lán)綠色）和葉綠素b（黃綠色）。

圖2 菠菜葉柱層析分離結(jié)果

[1]謝慶娟.分析化學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.

[2]尹桂山.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].石家莊：河北科學(xué)技術(shù)出版社，1989.

[3]王秀奇，秦淑媛，高天慧，等.基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].2版.北京：高等教育出版社，1996.

[4]曾昭瓊.有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].4版.北京：高等教育出版社，2004.

[5]耿三省，張平，王健查.胡蘿卜中胡蘿卜素含量測(cè)定方法[J].北京農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996（2）：24～26.

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