明恒磊，于 穎，劉 杰，王尚龍，袁寧寧，劉全蘭

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島 266042）

發(fā)酵液乳酸含量測(cè)定法中EDTA絡(luò)合滴定鈣指示劑的改進(jìn)

明恒磊，于 穎，劉 杰，王尚龍，袁寧寧，劉全蘭*

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島 266042）

乳酸是三大有機(jī)酸之一，其生產(chǎn)主要是生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法。當(dāng)前，乳酸的生產(chǎn)以生物發(fā)酵法為主。發(fā)酵生產(chǎn)過程中，乳酸含量的檢測(cè)是個(gè)關(guān)鍵問題。乳酸含量的測(cè)定方法較多，其中EDTA定鈣法因具有高靈敏性和易操作等優(yōu)點(diǎn)而得以廣泛應(yīng)用。EDTA定鈣法主要是通過鈣黃綠素指示劑的黃綠色熒光在滴定前后的有和無進(jìn)行乳酸測(cè)定。但該指示劑變色欠佳，滴定終點(diǎn)難以判斷。本研究對(duì)EDTA定鈣法的指示劑進(jìn)行改進(jìn)，即在鈣黃綠素指示劑中添加入茜素溶液為襯色劑。改進(jìn)的指示劑可提高顯色反應(yīng)的對(duì)比度，由滴定前的黃綠色熒光變?yōu)榈味ê蟮募t色，這使終點(diǎn)易于觀察和判斷，這將提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度。實(shí)驗(yàn)確定了茜素作為鈣黃綠素襯色劑的比例，即鈣黃綠素和茜素的較佳混合比例為1∶0.275～1∶0.3（g∶g）。

乳酸，EDTA滴定，鈣黃綠素，茜素

乳酸（lactic acid）分子式為C3H6O3，是三大有機(jī)酸之一，在自然界中主要以三種形式存在：D-乳酸（圖1），L-乳酸（圖2）和DL-乳酸。由于D-乳酸無法被人體所代謝，其應(yīng)用領(lǐng)域受到了一定的限制；而L-乳酸可被人體消化，其在食品、醫(yī)藥和日化等領(lǐng)域有更加廣泛的應(yīng)用[1-3]。乳酸的生產(chǎn)主要是生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法。生物發(fā)酵法發(fā)酵生產(chǎn)乳酸具有成本低、生產(chǎn)溫度溫和、能耗低且可以用于生產(chǎn)高光學(xué)純度單一構(gòu)型的乳酸等優(yōu)點(diǎn)[4]。化學(xué)合成法因其原料具有毒性，且只能生產(chǎn)DL混合型乳酸，其應(yīng)用日益受到限制。不僅如此，生物發(fā)酵法可利用可再生資源進(jìn)行發(fā)酵，如工業(yè)廢料、農(nóng)作物秸稈等都可發(fā)酵生成乳酸。因此，國(guó)內(nèi)外普遍以生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸[4-5]。發(fā)酵生產(chǎn)過程中，乳酸含量的檢測(cè)是個(gè)關(guān)鍵問題。乳酸含量的測(cè)定方法主要包括EDTA定鈣法[6]、對(duì)羥基聯(lián)苯法[7]、酶法[8]、高效液相色譜法[9]、反相高效液相色譜法[10]、氣相色譜法[11]和毛細(xì)管電泳法[12]等，其中EDTA定鈣法具有靈敏、簡(jiǎn)便和易于操作等特點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)化生產(chǎn)得到廣泛應(yīng)用[5-6]。該方法是以絡(luò)合反應(yīng)為基礎(chǔ)測(cè)定乳酸含量，測(cè)定原理是發(fā)酵液中的乳酸與CaCO3形成乳酸鈣后，用EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定乳酸鈣中的鈣，通過發(fā)酵液中乳酸與鈣定量反應(yīng)的關(guān)系，間接計(jì)算出乳酸含量[5-6]。絡(luò)合滴定鈣的指示劑中，鈣黃綠素靈敏度較高，多被選為EDTA定鈣法測(cè)定發(fā)酵液乳酸含量的指示劑[5-6]。發(fā)酵液pH調(diào)至大于12后，鈣黃綠素指示劑在滴定前的發(fā)酵液顯黃綠色熒光，滴定終點(diǎn)為黃綠色熒光消失而呈現(xiàn)橙色[5，13]。但此指示劑變色欠佳，肉眼難以察覺痕量熒光[14]。為使滴淀終點(diǎn)變色敏銳，使分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠，本研究對(duì)絡(luò)合滴定鈣指示劑進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化。

圖1 D-乳酸的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Mocular structure of D-lactic acid

圖2 L-乳酸的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Mocular structure of L-lactic acid

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，菌株號(hào)1.2158） 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物所；葡萄糖、蛋白胨 購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；K2HPO4、CaCO3購(gòu)自天津市巴斯夫化工有限公司；MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O和NaOH 購(gòu)自天津市博迪化工有限公司；CH3COONa 購(gòu)自天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；EDTA·Na2購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鈣黃綠素指示劑 購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；茜素指示劑 購(gòu)自南開大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)廠；實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 指示劑

1.2.1 鈣黃綠素指示劑結(jié)構(gòu)式和顯色反應(yīng)方式 鈣黃綠素（calcein）的分子式為C30H26N2O13，結(jié)構(gòu)式如圖3。該試劑為橙黃色粉末，配成溶液后因pH的變化表現(xiàn)出一定的變色規(guī)律。pH<11時(shí)，指示劑本身具有黃綠色熒光，此熒光可為Cu、Fe、Bi、A l、Ni、Pb、Mn等金屬離子所熄滅，但不為Cd、Zn所熄滅；pH>12時(shí)，指示劑本身沒有熒光，而和Sr、Ca、Ba、A l絡(luò)合呈黃綠色熒光，其中對(duì)Ca特別靈敏，可檢出0.08μg的Ca[13]。

圖3 鈣黃綠素的結(jié)構(gòu)式Fig.3 Mocular structure of calcein

1.2.2 茜素指示劑結(jié)構(gòu)式和顯色反應(yīng)方式 茜素（alizarin）的分子式為C14H8O4，結(jié)構(gòu)式如圖4。該試劑為橙黃色或黃棕色粉末，其水溶液呈淺黃褐色，能與許多金屬離子生成帶色化合物，能與Zr、Th、Al、Ti、Be、Ca等離子形成顯色反應(yīng)[15]。茜素試劑在堿性溶液中呈玫瑰紅色，本研究中茜素作為鈣黃綠素的襯色指示劑。

圖4 茜素的結(jié)構(gòu)式Fig.4 Mocular structure of alizarin

1.3 菌株培養(yǎng)與發(fā)酵

1.3.1 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）為MRS培養(yǎng)基[16]。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）的組成為：葡萄糖為150，酵母粉為2，蛋白胨為10，K2HPO4為2，CH3COONa為5，MgSO4·7H2O為0.58，MnSO4·4H2O為0.25，pH為6.2～6.4，121℃滅菌15min后，加入10%已滅菌的CaCO3作為發(fā)酵產(chǎn)酸的中和劑[17]。

1.3.2 液體培養(yǎng) 標(biāo)準(zhǔn)菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基活化后，挑取單菌落轉(zhuǎn)至相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，33℃，厭氧培養(yǎng)12h。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng) 50m L三角瓶中裝入20m L發(fā)酵培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)物按10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，33℃，厭氧發(fā)酵。取發(fā)酵96h后的發(fā)酵液進(jìn)行乳酸含量滴定。

1.4 EDTA絡(luò)合滴定鈣指示劑測(cè)定發(fā)酵液中乳酸含量

1.4.1 鈣黃綠素為指示劑測(cè)定發(fā)酵液中乳酸鈣（W1）

取發(fā)酵液5L，5000r/m in離心10m in，以除去菌體和碳酸鈣沉淀。吸取上清液1m L置于潔凈離心管中，加水50m L，加4m L濃度1mol/L NaOH以調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH大于12，鈣黃綠素指示劑0.02g，用濃度0.05mol/L EDTA·Na2溶液滴定至背光觀察黃綠色熒光轉(zhuǎn)變?yōu)槌壬珵橹?，并記錄消耗掉的體積V（m L）[5-6]。

乳酸鈣含量W1（mg）=218.2VC；

式中：V為滴定消耗EDTA·Na2的量（m L）；C為EDTA·Na2的濃度（mg/m L）。

發(fā)酵液中乳酸（W2）的測(cè)定：按照乳酸鈣和乳酸的摩爾比為1∶2，計(jì)算乳酸含量。

1.4.2 改進(jìn)的EDTA絡(luò)合滴定鈣指示劑 因鈣黃綠素為指示劑時(shí)，滴定終點(diǎn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)是黃綠色熒光消失轉(zhuǎn)變?yōu)槌壬?，變色不明顯，不便于觀察。本實(shí)驗(yàn)添加適量的茜素溶液為其襯色指示劑。為達(dá)到鈣黃綠素和茜素的最佳混合比例，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了7種混合比例。取茜素0.02g溶于1m L水中，從中取不同體積的茜素溶液與鈣黃綠素進(jìn)行混合（表1）。指示劑1的組成為鈣黃綠素0.02g，茜素溶液250μL，即g（鈣黃綠素）∶g（茜素）=1∶0.25；指示劑2的組成為鈣黃綠素0.02g，茜素溶液275μL，即g（鈣黃綠素）∶g（茜素）=1∶0.275；指示劑3的組成為鈣黃綠素0.02g，茜素溶液300μL，即g（鈣黃綠素）∶g（茜素）=1∶0.3；指示劑4的組成為鈣黃綠素0.02g，茜素溶液325μL，即g（鈣黃綠素）∶g（茜素）= 1∶0.325；指示劑5的組成為鈣黃綠素0.02g，茜素溶液350μL，即g（鈣黃綠素）∶g（茜素）=1∶0.35；指示劑6的組成為鈣黃綠素0.02g，茜素溶液375μL，即g（鈣黃綠素）∶g（茜素）=1∶0.375；指示劑7的組成為鈣黃綠素0.02g，茜素溶液400μL，即g（鈣黃綠素）∶g（茜素）=1∶0.4。

1.4.3 改進(jìn)指示劑測(cè)定發(fā)酵液中乳酸含量 分取按

1.4.1離心后的上清發(fā)酵液1m L，放置于7個(gè)試管中。每個(gè)試管中依次加水50m L，加濃度1mol/L的NaOH溶液4m L，然后分別加入指示劑1、2、3、4、5、6和7，用濃度0.05mol/L EDTA·Na2溶液滴定，觀察發(fā)酵液滴定前與滴定終點(diǎn)變色情況。

表1 鈣黃綠素和茜素以不同比例混合形成的EDTA絡(luò)合滴定鈣指示劑Table 1 Indicators in EDTA titration analysis composed by different rations of calcein and alizarin

2 結(jié)果與討論

2.1 改進(jìn)的EDTA絡(luò)合滴定鈣指示劑

實(shí)驗(yàn)中茜素作為鈣黃綠素的襯色指示劑，以探索EDTA定鈣法測(cè)定發(fā)酵液中乳酸含量的較佳指示劑。實(shí)驗(yàn)中，沒有茜素的鈣黃綠素在發(fā)酵液中的黃綠色熒光特征，滴定后顏色轉(zhuǎn)至為橙黃色。指示劑1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茜素溶液加入量等于250μL時(shí)，滴定前，添加茜素的鈣黃綠素在發(fā)酵液中的黃綠色熒光特征與沒有茜素的鈣黃綠素的黃綠色熒光特征相似，滴定后，終點(diǎn)轉(zhuǎn)至為橙黃色，不易觀察和確定熒光消失的終點(diǎn)。指示劑2和3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茜素溶液加入量為275、300μL時(shí)，滴定前，添加茜素的鈣黃綠素在發(fā)酵液中的黃綠色熒光特征與沒有茜素的鈣黃綠素的黃綠色熒光特征相似；滴定后，終點(diǎn)以綠色熒光消失轉(zhuǎn)至明顯紅色，變色明顯，易判斷。指示劑4、5、6和7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茜素溶液加入量大于325μL時(shí)，鈣黃綠素在發(fā)酵液的黃綠色熒光特征變?nèi)酰@容易加大乳酸測(cè)定的誤差。因而，茜素溶液的適宜加入量為275～300μL。若小于275μL，變色不明顯，有少量殘余熒光；大于300μL，滴定前溶液紅色較深，掩蓋住了熒光，目視觀察效果不好。指示劑的滴定效果列于表2。因而，通過滴定前和滴定后顯色變化的靈敏性，實(shí)驗(yàn)確定最佳的混合指示劑為指示劑2和3，即g（鈣黃綠素）∶g（茜素）在1∶0.275～1∶0.3之間。

表2 EDTA絡(luò)合滴定鈣指示劑在發(fā)酵液滴定時(shí)和滴定終點(diǎn)的顏色變化Table 2 The color variation of the indicator in EDTA titration analysis of lactic acid

2.2 乳酸含量測(cè)定

采用EDTA定鈣法，測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)菌株植物乳桿菌1.0557培養(yǎng)96h后的發(fā)酵液中乳酸含量。測(cè)試時(shí)，平行重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EDTA用量在不同指示劑中有所不同（表3）。僅鈣黃綠素為指示劑時(shí)，EDTA用量為10.2m L；此時(shí)，肉眼判斷為滴定終點(diǎn)，即發(fā)酵液中的黃綠色熒光變?yōu)槌壬障鄨D片顯示滴定終點(diǎn)時(shí)有熒光殘留。指示劑2和3進(jìn)行滴定時(shí)，EDTA用量為10.3m L；此時(shí)，肉眼判斷為滴定終點(diǎn)，即發(fā)酵液中的黃綠色熒光變?yōu)榧t色，照相圖片表明滴定終點(diǎn)時(shí)無熒光殘留。指示劑4進(jìn)行滴定時(shí)，由于指示劑中茜素含量較多而削弱了發(fā)酵液中的黃綠色熒光，這使滴定終點(diǎn)時(shí)EDTA用量為10.2m L；此時(shí)，發(fā)酵液中的黃綠色熒光變?yōu)榧t色，照相圖片表明滴定終點(diǎn)時(shí)無熒光殘留。

表3 不同指示劑在定鈣法測(cè)發(fā)酵液中乳酸含量所用的EDTA量Table 3 The EDTA volume used by the different indicator at the end pointof titration

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鈣黃綠素和茜素組成的混合指示劑用于乳酸發(fā)酵液EDTA定鈣法時(shí)，滴定終點(diǎn)變色明顯，發(fā)酵液的黃綠色熒光消失轉(zhuǎn)至明顯紅色，這使滴定終點(diǎn)易于判斷，方便實(shí)驗(yàn)操作。茜素顯色原理和實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明茜素可絡(luò)合Ca，這將減少鈣黃綠素結(jié)合的Ca量而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為減小茜素造成的實(shí)驗(yàn)誤差，對(duì)鈣黃綠素和茜素組合的最佳比較進(jìn)行探討，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鈣黃綠素和茜素的最佳比例在1∶0.275～1∶0.3（g∶g）間，是較佳混合指示劑。滴定結(jié)果表明，合適比例的鈣黃綠素和茜素混合指示劑，既不影響滴定前的黃綠色熒光，又讓滴定終點(diǎn)顯出紅色的明顯顏色變化。因而，本文結(jié)果表明僅用鈣黃綠素為指示劑時(shí)影響終點(diǎn)顏色的判定，這可能導(dǎo)致終點(diǎn)滯后和終點(diǎn)提前等問題；鈣黃綠素和茜素按比例形成的混合物可作為測(cè)定乳酸發(fā)酵液鈣含量的最佳指示劑，終點(diǎn)顏色由黃綠色變化為紅色，顏色鮮艷，變色敏銳，這將能夠快速、準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便地測(cè)定發(fā)酵液乳酸含量。

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Im proved indicators in EDTA titration analysis of lactic acid in fermented broth

M ING Heng-lei，YU Ying，LIU Jie，WANG Shang-long，YUAN Ning-ning，LIU Quan-lan*
（College of Chemical Engineering，Qingdao University of Science&Technology，Qingdao 266042，China）

EDTA titration was a main method for the determ ination of lactic acid in fermented b roth．The color variation of calcein was used to confirm the end point of titration，which is that the original yellow-green fluorescence shifted to the orange color at the end point of EDTA titration.However，the color variation was not sharp，whichmade some obscurity in confirm ing the end pointof titration.To imp rove the color variation degree，alizarin was m ixed together w ith calcein in a p roportion in this study；and the color variation d isp layed an obvious shift，which exp ressed by the fact that the original yellow-green fluorescence was turned into the obvious red color at the end point of titration.The results suggested that the im p roved ind icatormade from the m ixture of alizarin and calcein was a better ind icator，because the color variation of end point was more sensitive；the best p roportion of calcein to alizarin was 1∶0.275～1∶0.3（g∶g）.

lactic acid；EDTA titration；calcein；alizarin

TS207.3

A

1002-0306（2012）09-0387-04

2011－08－25 *通訊聯(lián)系人

明恒磊（1987-），男，碩士研究生，主要從事微生物種質(zhì)資源和發(fā)酵工藝研究。

國(guó)家十二五科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD17B04）；國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助（MBSMAT-2010-05）。