梁 宇，黃世江，王超海，程定璽,*

(1.河南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.新鄉(xiāng)學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

熒光探針?lè)焖贆z測(cè)果汁中羅丹明B殘留量

梁 宇1,2，黃世江1，王超海2，程定璽1,*

(1.河南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.新鄉(xiāng)學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

建立以伊紅Y為熒光探針測(cè)定羅丹明B殘留量的熒光光譜法。在pH6.8的Sфrensen緩沖溶液中，一定濃度的陽(yáng)離子表面活性劑溴化十六烷基三甲基銨(CTMAB)能使陰離子染料伊紅Y的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，當(dāng)加入一定量的羅丹明B后其熒光發(fā)生猝滅，且猝滅程度在一定范圍內(nèi)與加入的羅丹明B濃度呈正比。通過(guò)改變單因素，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，獲得的線性范圍為0～0.9mg/L，檢出限為0.0016mg/L，回收率為101.3%～113.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.76%～4.98%。該方法具有簡(jiǎn)便快捷、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于果汁飲料制品中羅丹明B的檢測(cè)。

熒光探針；伊紅Y；羅丹明B；殘留

羅丹明B(rhodamine B，RhB)是一種人工合成染料，常用做熒光分析試劑[1]。有研究表明：羅丹明B能引起皮下組織生瘤，具有致癌性[2]。根據(jù)國(guó)際癌癥研究署(IARC)化學(xué)品致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)表明：攝取、吸入以及皮膚接觸該物質(zhì)均會(huì)造成急性和慢性的中毒傷害[3]。早在20世紀(jì)末，歐美、日本等國(guó)家和地區(qū)就己明令禁止將羅丹明B用于食品加工中，我國(guó)也將其列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單(第一批)》進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)管。但由于羅丹明B具有價(jià)格低廉、著色穩(wěn)定、色澤鮮艷等特點(diǎn)，將其添加到食品中的違法事件仍時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重危害人們的飲食安全。

然而目前對(duì)食品中羅丹明B的檢測(cè)仍沒(méi)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)行的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[4]和現(xiàn)有的檢驗(yàn)方法主要是色譜法[5-9]和酶聯(lián)免疫法[10-11]，這些方法分析儀器昂貴，樣品前處理繁瑣，檢測(cè)耗時(shí)。羅丹明B本身雖具有很強(qiáng)的熒光，但在本實(shí)驗(yàn)測(cè)量范圍內(nèi)其熒光強(qiáng)度較低，而且在處理樣品時(shí)有機(jī)溶劑對(duì)羅丹明B的熒光強(qiáng)度影響很大。本研究探究并建立用熒光探針快速檢測(cè)羅丹明B的熒光光譜法，快速測(cè)定果汁中羅丹明B殘留量，可為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的建立和測(cè)定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果汁飲料 市售。

羅丹明B(分析純) 天津市化學(xué)試劑一廠；伊紅Y(EY)(分析純) 上?；瘜W(xué)試劑總廠；溴化十六烷基三甲基銨(CTMAB)(分析純) 上海試劑一廠；甲醇、乙醇、丙酮和乙睛(均為分析純) 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-2064高速冷凍離心機(jī) 上海金鵬分析儀器有限公司；FP-6500型熒光光譜儀 日本Jasco公司；KQ-218超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

[12]方法：準(zhǔn)確移取1.0mL果汁于50mL具塞離心管中，加入25mL 20%的甲醇溶液后超聲振蕩30min，然后以8000r/min的速度離心10min。取部分上清液于10rnL容量瓶中，并用水定容，即得到待測(cè)樣品溶液，備用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

在一系列10mL容量瓶中依次加入1.0mL濃度為1.0×10-4mol/L的伊紅Y溶液，0.8mL pH值為6.8的Sфrensen緩沖溶液，0.8mL濃度為1.0×10-2mol/L的CTMAB和10mg/L羅丹明B溶液，振蕩使其充分反應(yīng)，靜置15min后，用波長(zhǎng)為531nm的激發(fā)光激發(fā)，測(cè)定其在547nm波長(zhǎng)處的發(fā)射光強(qiáng)度I，同時(shí)在相同條件下測(cè)定空白對(duì)照液的熒光強(qiáng)度I0。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜

圖1 熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra

如圖1所示，在pH值為6.8的Sфrensen緩沖溶液中，EY的最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為520nm和538nm(曲線1)，當(dāng)向其中加入一定量的羅丹明B后，其熒光強(qiáng)度隨著羅丹明B濃度的增大而略有降低(曲線2、3)。相同條件下，當(dāng)向EY中加入一定濃度的CTMAB后，溶液的顏色由粉紅色變成桃紅色，體系的最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別紅移至531nm和547nm，且熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(曲線4)；當(dāng)再向其中加入一定量的羅丹明B后，體系的熒光強(qiáng)度降低(曲線5、6)，且降低的程度與加入羅丹明B的量在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，因此該體系可用于羅丹明B殘留量的測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)機(jī)理可能是：表面活性劑CTMAB濃度達(dá)到一定濃度后，形成膠束，對(duì)EY有增敏效應(yīng)，使其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。因?yàn)镋Y與羅丹明B之間的作用力大于EY與CTMAB之間的作用力，所以當(dāng)向EY-CTMAB體系中加入羅丹明B后，羅丹明B替代了CTMAB的位置。又由于羅丹明B對(duì)EY的熒光增敏效應(yīng)小于CTMAB的膠束增敏效應(yīng)，所以體系的總體熒光強(qiáng)度隨羅丹明B濃度的增加而呈下降趨勢(shì)。

2.2 條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 反應(yīng)體系的選擇

分別選取陽(yáng)離子型、陰離子型和非離子型表面活性劑各兩種，與EY形成EY-CTMAB、EY-CPB、EYSDBS、EY-SDS、EY-OP和EY-Tween-80等體系進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：以EY-CTMAB體系進(jìn)行測(cè)定時(shí)，ΔI值最大(ΔI＝I0－I，I0和I分別為未加入和加入羅丹明B時(shí)體系的熒光值)，靈敏度最高且體系最穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)選取EY-CTMAB體系。

2.2.2 緩沖溶液及酸度的選擇

已知EY在近中性和微堿性環(huán)境中發(fā)強(qiáng)熒光，因此選取pH值為7.0的Kolthoff、Sφrensen、Michaelis、Britton-Robinson、Clark-Lubs等幾種緩沖溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：在Sфrensen緩沖溶液中得到的ΔI值最大，因此本實(shí)驗(yàn)選取Sфrensen緩沖溶液。接著使用pH值為5.0～10.0的系列Sфrensen緩沖溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：當(dāng)pH≤7.0時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度隨著pH值的增大逐漸增強(qiáng)，體系的靈敏度也逐漸升高；當(dāng)pH 7.0～9.0時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度基本穩(wěn)定；當(dāng)pH≥9.0時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度隨著pH值的增大而迅速降低。當(dāng)pH≥7.0時(shí)，體系的靈敏度先略有降低后保持穩(wěn)定。當(dāng)pH6.8時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度和靈敏度均達(dá)到最大，且此時(shí)獲得的線性關(guān)系良好。因此本實(shí)驗(yàn)選取緩沖溶液的pH值為6.8。

2.2.3 最佳EY濃度的選擇

在一定范圍內(nèi)，體系的熒光強(qiáng)度隨著EY濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，并且體系的靈敏度ΔI值隨EY濃度的增大增加到最大后趨于穩(wěn)定。當(dāng)EY濃度達(dá)到1.0×10-5mol/L時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，靈敏度最大且穩(wěn)定，并且此時(shí)體系具有很好的線性關(guān)系，所以本實(shí)驗(yàn)選取1.0×10-5mol/L為EY的最佳濃度。

2.2.4 最佳CTMAB濃度的選擇

在一定濃度范圍內(nèi)，體系的熒光強(qiáng)度隨著CTMAB濃度的增加迅速增大到最大值后保持穩(wěn)定，靈敏度先迅速升高后又略微降低。當(dāng)CTMAB的濃度為8.0×10-4mol/L時(shí)，體系的靈敏度ΔI有最大值，且此時(shí)體系的熒光強(qiáng)度較高，因此本體系選擇8.0×10-4mol/L為CTMAB的最佳濃度。

2.2.5 緩沖溶液用量的選擇

隨著緩沖溶液用量的增加，體系的熒光強(qiáng)度逐漸增加到最大后保持不變，而靈敏度隨著緩沖溶液用量的增加卻有所降低。當(dāng)緩沖溶液用量為0.8mL時(shí)，體系的靈敏度最高且體系的熒光強(qiáng)度有最大值。本實(shí)驗(yàn)最終選定0.8mL為緩沖溶液最合適用量。

2.2.6 試劑加入順序的選擇

按照排列組合原理，本實(shí)驗(yàn)考察4種不同試劑共24種不同加入順序?qū)w系熒光強(qiáng)度的影響。當(dāng)加入順序?yàn)镋Y→CTMAB→Sфrensen→羅丹明B和EY→Sфrensen→CTMAB→羅丹明B時(shí)，體系的靈敏度ΔI較大，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)選擇的加入順序?yàn)椋篍Y→CTMAB→Sфrensen→羅丹明B。

2.2.7 反應(yīng)溫度和時(shí)間的影響

隨著溫度的升高，體系的熒光強(qiáng)度逐漸降低，體系的靈敏度也略有降低，因此實(shí)驗(yàn)應(yīng)在較低溫度下進(jìn)行。體系在反應(yīng)15min后達(dá)到穩(wěn)定且在2h內(nèi)熒光強(qiáng)度減幅在5%以內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)選取在室溫20℃條件下反應(yīng)15min后進(jìn)行測(cè)定。

2.2.8 離子強(qiáng)度的影響

通過(guò)加入0.1mol/L的NaCl溶液來(lái)考察離子強(qiáng)度對(duì)體系的影響。離子強(qiáng)度對(duì)體系的影響很小，隨著NaCl加入量的增加，體系的熒光強(qiáng)度略有增強(qiáng)，而靈敏度卻稍有降低。因此本實(shí)驗(yàn)在測(cè)定時(shí)選擇不加入NaCl溶液，不改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度。

2.2.9 有機(jī)溶劑的影響

通過(guò)向體系中添加甲醇、乙醇、丙酮和乙腈等幾種常見(jiàn)有機(jī)溶劑，來(lái)考察處理樣品時(shí)帶入的有機(jī)溶劑對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。隨著甲醇含量的增加，體系的熒光強(qiáng)度逐漸降低。隨著乙醇和乙腈含量的增加，體系的熒光強(qiáng)度均略有增強(qiáng)。當(dāng)丙酮含量小于7%時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度基本不變；當(dāng)丙酮含量大于7%時(shí)，隨著丙酮含量的增加體系的熒光強(qiáng)度迅速降低。但是隨著4種有機(jī)溶劑含量的增加，體系的靈敏度均逐漸降低。因此，在處理樣品時(shí)，應(yīng)避免使用或盡量少用有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)在處理樣品時(shí)引入的甲醇經(jīng)多次稀釋后，其含量不會(huì)對(duì)測(cè)量結(jié)果造成明顯影響。

2.3 工作曲線

按前述實(shí)驗(yàn)方法，得到測(cè)定羅丹明B殘留量的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性方程為：I＝450.6－347.1C/(mg/L)，R＝0.9996，線性范圍為0～0.9mg/L。對(duì)含量為0.4mg/L的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液11次平行測(cè)定的平均值為0.3963mg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.29%。

2.4 干擾物質(zhì)的影響

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，考察果汁飲料中常見(jiàn)離子和物質(zhì)對(duì)羅丹明B含量測(cè)定的影響。當(dāng)羅丹明B溶液質(zhì)量濃度為0.2mg/L，相對(duì)誤差控制在±5%以內(nèi)，測(cè)定時(shí)各種物質(zhì)的最大允許倍數(shù)分別是：Na+、K+、Cl－、Br－(2000)，L-精氨酸、L-賴氨酸、L-脯氨酸、L-半光氨酸、L-甘氨酸、葡萄糖(1000)，VC、VE、NH4+(500)，Mg2+、Zn2+(300)，Ca2+(200)，F(xiàn)e3+、Cu2+(100)。由于樣品被稀釋，測(cè)定時(shí)上述共存物質(zhì)允許倍數(shù)均大于其在果汁飲料中的相對(duì)值，對(duì)羅丹明B的測(cè)定不會(huì)有明顯的干擾。

2.5 樣品測(cè)定及回收率實(shí)驗(yàn)

對(duì)市售的5種果汁飲料進(jìn)行測(cè)定，均未檢出羅丹明B。準(zhǔn)確量取1.0mL果汁4份于4支50mL具塞離心管中做加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)水平為0.1、0.2、0.4、0.8mg/L，混合均勻，密封放置1d，然后按1.3.1節(jié)對(duì)樣品進(jìn)行處理，每個(gè)平行測(cè)定6次，測(cè)得回收率為101.3%～113.7%，RSD為2.76%～4.98%。

3 結(jié) 論

本研究建立了以伊紅Y為熒光探針測(cè)定果汁類飲料中羅丹明B殘留量的熒光光譜法。該方法樣品處理簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、用樣量少、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)。為羅丹明B殘留量的檢測(cè)提供了一種快速簡(jiǎn)便靈敏準(zhǔn)確可靠的新檢測(cè)方法。

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Rapid Determination of Rhodamine B Residues in Fruit Drink by Fluorescent Probe Assay

LIANG Yu1,2，HUANG Shi-jiang1，WANG Chao-hai2，CHENG Ding-xi1,*
(1. School of Chemistry and Environmental Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China ；2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinxiang University, Xinxiang 453003, China)

A new fluorescence spectrometr y method for the determination of rhodamine B (RhB) was established by the use of eosin Y (EY) as fluorescent probe. In Sфrensen buffer solution at pH 6.8, the fluorescence intensity of anionic dye EY can be significantly enhanced by adding cetyltrimethylammonium bromide (CTMAB), a cationic surfactant. However, RhB has the ability to quench the fluorescence in a proportional manner within a certain concentration range. In this study, one-factor-at-atime designs were used to determine the optimal experimental conditions for the determination of RhB. The linear range,detection limit and average recovery rate of the developed assay were 0－0.9 mg/L, 0.0016 mg/L, and 101.3%－113.7% with relative standard deviation of 2.76%－4.98%, respectively. This method is simple, quick, selective and sensitive so that it is suitable for the determination of RhB residues in fruit drink products.

fluorescent probe；eosin Y；rhodamine B；residue

O657.3

A

1002-6630(2012)18-0258-03

2012-05-20

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(102102210043)

梁宇(1970—)，女，副教授，碩士，研究方向?yàn)榄h(huán)境分析。E-mail：sunrain732002@sina.com

*通信作者：程定璽(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樗幬锓治龊褪称诽砑觿┘稗r(nóng)藥殘留檢測(cè)。E-mail：chengdingxi@yahoo.com.cn