米 思，李 華*，劉 晶

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；

2.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

響應(yīng)面法優(yōu)化毛葡萄酒泥中L(＋)-酒石酸提取工藝

米 思1，李 華2,*，劉 晶2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；

2.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化毛葡萄酒泥提取L(＋)-酒石酸工藝中的酸浸和沉降兩個(gè)技術(shù)參數(shù)。結(jié)果得出酸浸的最佳工藝參數(shù)為：溫度82℃、時(shí)間7min、37%鹽酸8mL(以100mL毛葡萄酒泥計(jì))；沉降的最優(yōu)工藝參數(shù)為：CaCl2質(zhì)量濃度50g/L、pH6.64、反應(yīng)時(shí)間2.4h。在此條件下，毛葡萄酒泥中L(＋)-酒石酸的實(shí)際酸浸提量為41.63g/L，實(shí)際提取回收率可達(dá)87.64%。

毛葡萄；酒泥；L(＋)-酒石酸；響應(yīng)面法；提取工藝

毛葡萄(Vitis quinquangulanis Rehd.)又名野葡萄、五角葉葡萄、雞葡萄，是原產(chǎn)于我國本土的珍稀野生釀酒葡萄品種之一，是我國葡萄屬東亞種群中蘊(yùn)藏量最大、分布最廣的一個(gè)野生種[1]，在中國秦嶺、秦山以南至廣西境內(nèi)均有分布，其漿果具有酸高、糖低、單寧含量高三個(gè)顯著特點(diǎn)。L(＋)-酒石酸(又名右旋-2,3-二羥基丁二酸)是一種天然有機(jī)酸，主要存在于葡萄及羅望子果實(shí)中，是葡萄酒中主要的有機(jī)酸之一，也是酒石酸四種異構(gòu)體中最有價(jià)值的一種，在食品、醫(yī)藥及化工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[2-3]。

我國L(＋)-酒石酸的生產(chǎn)起步較晚，80年代開始才進(jìn)行探索性的L(＋)-酒石酸試驗(yàn)研究，已形成規(guī)模的生產(chǎn)廠家較少，主要集中在江浙一帶。目前存在的L(＋)-酒石酸的生產(chǎn)方法主要有4種：抽提法、糖質(zhì)發(fā)酵法、化學(xué)拆分法、酶合成法[4]。葡萄酒的釀造過程通常伴隨大量廢棄物的產(chǎn)生，如葡萄皮渣、酒泥、粗酒石等。抽提法是指直接從葡萄工業(yè)廢料中提取得到L(＋)-酒石酸，這是最早使用的方法，意大利、西班牙等西歐國家一般依據(jù)此法從粗酒石中提取L(＋)-酒石酸，但是目前國內(nèi)外對(duì)于以葡萄酒泥為原料提取L(＋)-酒石酸的方法罕有研究。酒泥是葡萄酒釀造過程中產(chǎn)生的一種重要的副產(chǎn)物，占葡萄鮮果干質(zhì)量的3.5%～8.5%，其中酒石酸含量約為100～150kg/t[5-6]，數(shù)量十分可觀。因此以葡萄酒工業(yè)酒泥為基礎(chǔ)，優(yōu)化L(＋)-酒石酸的提取工藝，對(duì)提高L(＋)-酒石酸產(chǎn)量及降低其生產(chǎn)成本具有重要意義。此外，本實(shí)驗(yàn)選擇以野生毛葡萄酒泥為原料進(jìn)行研究，不僅充分利用了毛葡萄含酸量高這一特點(diǎn)，而且為我國特色野生植物資源的深度開發(fā)利用創(chuàng)造了新的途徑，對(duì)改善山區(qū)環(huán)境和解決山區(qū)農(nóng)民貧困問題具有重要意義。

響應(yīng)曲面法是一種優(yōu)化試驗(yàn)條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，被廣泛的應(yīng)用于食品工業(yè)及化學(xué)工業(yè)中[7-10]。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法對(duì)毛葡萄酒泥中L(＋)-酒石酸的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為L(zhǎng)(＋)-酒石酸的大規(guī)模生產(chǎn)及研究提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛葡萄酒泥：由廣西都安密洛陀野生葡萄酒有限公司提供，蒸餾，放入冰箱，4℃保存?zhèn)溆?；冰醋酸、氫氧化鈉、偏釩酸鈉、酒石酸、濃鹽酸、碳酸鈣、氯化鈣(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

723A型可見分光光度計(jì)、pHS-3C型pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；JB-2型恒溫磁力攪拌器 上海智光儀器儀表有限公司；GSY-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋 北京醫(yī)療設(shè)備廠有限責(zé)任公司；TDL-40B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器有限公司；101A-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 L(＋)-酒石酸的提取工藝

工藝流程：毛葡萄酒泥→酸浸→離心→沉降→過濾→酸解→脫色→結(jié)晶→L(＋)-酒石酸晶體。

操作要點(diǎn)：取預(yù)先經(jīng)過蒸餾處理的毛葡萄酒泥100mL，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方案進(jìn)行L(＋)-酒石酸的提取。酸浸結(jié)束后，離心、去殘?jiān)?，得到上清液，向上清液中加入?xì)粉狀CaCO3，邊加邊攪拌，使溶液達(dá)到pH7.0，將生成的酒石酸鈣移出，向余下的料液中按試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入CaCl2進(jìn)行沉降、靜置后，將上述兩步生成的沉淀物合并，然后加入40℃熱水95mL及5mL、37%的鹽酸進(jìn)行溶解，最后酸解液經(jīng)脫色、結(jié)晶，得到L(＋)-酒石酸，稱量并計(jì)算L(＋)-酒石酸的回收率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。計(jì)算L(＋)-酒石酸回收率：

式中：A為酸浸提液中L(＋)-酒石酸的質(zhì)量濃度/(g/L)；C為酸解液中L(＋)-酒石酸的質(zhì)量濃度/(g/L)。

1.3.2 L(＋)-酒石酸含量的測(cè)定方法

采用偏釩酸鈉溶液比色法[11]。在室溫條件下，500nm波長(zhǎng)處測(cè)定L(＋)-酒石酸質(zhì)量濃度與吸光度的數(shù)學(xué)關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y＝0.2087x＋0.675，R2＝0.9982。該方程擬合度良好，可以用于L(＋)-酒石酸含量的計(jì)算。

1.3.3 L(＋)-酒石酸提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案[12-15]，分別以L(＋)-酒石酸酸浸提量和L(＋)-酒石酸回收率為響應(yīng)值，利用Design Expert 7.0進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化L(＋)-酒石酸的提取工藝。酸浸和沉降兩步的試驗(yàn)因素和所選水平分別見表1、2。

表1 L(+)-酒石酸提取工藝酸浸工序響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization extraction parameters used in the response surface

表2 L(+)-酒石酸提取工藝沉降工序響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 2 Coded values and corresponding real values of the optimization precipitation parameters used in the response surface

2 結(jié)果與分析

2.1 酸浸工序試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，采用數(shù)據(jù)處理軟件Design Expert 7.0對(duì)表3進(jìn)行擬合的二次模型方差分析，分析結(jié)果見表4。

當(dāng)P＜0.05時(shí)，表明該項(xiàng)指標(biāo)顯著。由表4可知該工序建立的回歸模型是極顯著的(P＜0.0001)，失擬項(xiàng)P＝0.2356＞0.05，不顯著；并且多元相關(guān)系數(shù)R2＝0.9992，調(diào)整R2＝0.9978，說明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合情況良好，可以用該回歸方程代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析；變異系數(shù)CV＝1.73%，變異性較小。

回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著程度，由F檢驗(yàn)來判定，概率P(F＞Fα)的值越小，則說明該變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著程度越高。表4顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，一次項(xiàng)X1、X2、X3的影響極顯著，交互項(xiàng)X1X2影響顯著，X1X3影響極顯著，二次項(xiàng)X22影響極顯著。由此可知，各試驗(yàn)因素對(duì)L(＋)-酒石酸酸浸提量的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表3 L(+)-酒石酸提取工藝酸浸工序Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design and corresponding experimental results for optimizing acid extraction parameters

表4 酸浸工序回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA of the regression equation describing acid extraction

對(duì)表3結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到各因素對(duì)L(＋)-酒石酸酸浸提量(Y1)影響的多元二次回歸方程模型：

通過對(duì)上述多元二次回歸方程進(jìn)行分析求解，得到L(＋)-酒石酸酸浸提的最優(yōu)工藝參數(shù)：酸浸溫度82.2℃、37% 鹽酸8.04mL、酸浸時(shí)間7.15min，考慮到實(shí)際操作的便利，將L(＋)-酒石酸的酸浸提最佳工藝條件修正為酸浸溫度82℃、37%鹽酸體積8mL、酸浸時(shí)間7min。在此條件下，L(＋)-酒石酸理論預(yù)測(cè)值為42.55g/L，實(shí)際測(cè)得的值為41.63g/L，表明該模型合理可行。

對(duì)酸浸提中有交互作用的因素所做的響應(yīng)面圖見圖1。由圖1a可知，在37%鹽酸體積不變的前提下，隨著溫度的升高，L(＋)-酒石酸的浸提量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。因?yàn)榫颇嘀械腖(＋)-酒石酸主要是以酒石酸氫鉀和酒石酸鈣的形式存在的，溫度越高，酒石酸氫鉀的溶解度越大，反應(yīng)越容易進(jìn)行，溫度的升高還能夠增加體系中分子的熱運(yùn)動(dòng)，從而導(dǎo)致L(＋)-酒石酸的浸提更容易進(jìn)行。在溫度不變的條件下，隨著37%鹽酸體積的增加，L(＋)-酒石酸的浸提量先升高，在37%鹽酸體積接近8mL時(shí)，出現(xiàn)緩慢下滑趨勢(shì)。酒泥中主要存在3種有機(jī)酸：蘋果酸、酒石酸、檸檬酸，其中酒石酸是最強(qiáng)的酸。如果37%鹽酸加入過量，會(huì)同時(shí)使其他種類的有機(jī)弱酸浸提到溶液中，進(jìn)而對(duì)L(＋)-酒石酸的浸提造成干擾，影響其提取量。

圖1 各兩因素交互作用對(duì)(＋)-酒石酸酸浸提量影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plot for the interactive effects between extraction temperature and the amount of 37% HCl addition or extraction time on the extraction rate of L(+)-tartaric acid

由圖1b可知，在酸浸時(shí)間不變的情況下，隨著酸浸溫度的升高，L(＋)-酒石酸的浸提量變化不明顯。在浸提溫度不變的條件下，隨著酸浸時(shí)間的延長(zhǎng)，L(＋)-酒石酸的浸提量出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，變化較明顯。葡萄酒泥是一種混合物，如果浸提時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使酒泥中的色素、糖等有機(jī)物充分浸出，由于這些有機(jī)物的干擾，L(＋)-酒石酸的浸提量開始下降。

2.2 沉降工序試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化結(jié)果

在前期得到的酸浸提最優(yōu)工藝參數(shù)的基礎(chǔ)上，以L(＋)-酒石酸回收率(Y2)為響應(yīng)值，采用相同的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法及數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)沉降工序工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

表5 L(＋)-酒石酸提取工藝沉降工序Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Box-Behnken design and corresponding experimental results for optimizing precipitation parameters

表6 沉降工序回歸模型方差分析Table 6 ANOVA of the regression equation describing CaCl2 precipitation

從表6可以看出，一次項(xiàng)X4、X6對(duì)響應(yīng)值影響極顯著，交互項(xiàng)X4X6、X5X6影響極顯著，此外，二次項(xiàng)X42和X52的影響也極顯著，這表明各因素均不同程度的對(duì)響應(yīng)值產(chǎn)生影響，因此本試驗(yàn)的因素選擇合理。從表6還可知，對(duì)L(＋)-酒石酸沉降工序建立的模型是極顯著的(P＝0.0004)，失擬項(xiàng)(P＝0.5668＞0.05)不顯著；并且該模型R2＝0.9859，調(diào)整R2＝0.9604，說明響應(yīng)值的變化有98.59%來源于所選變量，回歸方程對(duì)實(shí)際試驗(yàn)擬合程度較好。變異系數(shù)CV＝1.73%，說明建立的模型可以代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

以L(＋)-酒石酸的回收率為響應(yīng)值(Y2)，各因素經(jīng)過二次回歸擬合后，得到的多元二次回歸方程為：

對(duì)回歸方程(2)進(jìn)行進(jìn)一步分析求解，得到沉降工序的最優(yōu)工藝條件：CaCl2質(zhì)量濃度50.15g/L、pH6.64、反應(yīng)時(shí)間2.36h，理論回收率為88.34%?？紤]到實(shí)際操作的便利，將得到最優(yōu)工藝參數(shù)修正為CaCl2質(zhì)量濃度50g/L、pH6.64、反應(yīng)時(shí)間2.4h，在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)，得到L(＋)-酒石酸的回收率為87.64%，比理論預(yù)測(cè)值低0.79%，因此，利用響應(yīng)面分析法得到的沉降工序的工藝參數(shù)合理可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

L(＋)-酒石酸沉降工序中，對(duì)響應(yīng)值產(chǎn)生交互作用影響的各因素的響應(yīng)面圖分別見圖2。

圖2 各兩因素交互作用對(duì)L(＋)-酒石酸回收率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plot for the interactive effects between reaction time and the amount of CaCl2 addition or pH on the extraction rate of L(+)-tartaric acid

由圖2a可知，隨著CaCl2質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間的增加，L(＋)-酒石酸的回收率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而且變化明顯。加入CaCl2的目的是為了將溶液中的酒石酸鹽類及酒石酸全部轉(zhuǎn)化為酒石酸鈣沉淀，因此CaCl2質(zhì)量濃度越大，反應(yīng)越充分，最終回收得到的酒石酸的量也就更多；同樣，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，反應(yīng)會(huì)更加徹底，也會(huì)使L(＋)-酒石酸的回收率上升。

圖2b直觀的反映了在CaCl2質(zhì)量濃度一定的條件下，pH值和反應(yīng)時(shí)間對(duì)L(＋)-酒石酸回收率產(chǎn)生的交互影響。在反應(yīng)時(shí)間不變的情況下，隨著pH值的變化，L(＋)-酒石酸的回收率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在pH值接近7時(shí)，回收率達(dá)到最大值。因?yàn)長(zhǎng)(＋)-酒石酸的沉降反應(yīng)是在一個(gè)混合溶液體系中進(jìn)行的，其中包含很多的膠體物質(zhì)，如色素、單寧與色素生成的絡(luò)合物、磷酸鐵等，這些膠體物質(zhì)在遠(yuǎn)離它們的等電點(diǎn)處會(huì)發(fā)生絮凝作用而生成沉淀，因此pH值過大或是過小都可能影響L(＋)-酒石酸的回收。

3 結(jié) 論

通過響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化L(＋)-酒石酸提取過程中的酸浸和沉降兩個(gè)重要參數(shù)，最終得到L(＋)-酒石酸酸浸的最優(yōu)工藝參數(shù)為：酸浸溫度82℃、37%鹽酸體積8mL(以100mL毛葡萄酒泥計(jì))、酸浸時(shí)間7min；沉降工序的最佳工藝參數(shù)為：CaCl2質(zhì)量濃度50g/L、pH6.64、反應(yīng)時(shí)間2.4h。照上述工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，毛葡萄酒泥中L(＋)-酒石酸的實(shí)際酸浸提量為41.63g/L，實(shí)際回收率可達(dá)87.64%，與預(yù)測(cè)值接近，且重現(xiàn)性較好，證明優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

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Optimization of Extraction Process for L(+)-Tartaric Acid from Vitis quinquangularis Lees via Response Surface Methodology

MI Si1，LI Hua2,*，LIU Jing2
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；
2. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

On the basis of one-factor-at-a-time experiments, Box-Behnken design (BBD) and response surface methodology(RSM) were applied to optimize extraction with 37% HCl and subsequent precipitation with CaCl2 involved in the extraction of L(+)-tartaric acid from Vitis quinquangularis lees. The optimal HCl treatment conditions were 82 ℃ of temperature, 7 min of treatment time and 18% (V/V) of lees-to-HCl. The optimal precipitation conditions were addition of CaCl2 at a ratio of 50 g/L for 2.4 h of precipitation at pH 6.64. Under these conditions, the L(+)-tartaric acid yield from Vitis quinquangularis lees was 41.63 g/L and the actual recovery rate of L(+)-tartaric acid was 87.64%.

Vitis quinquangularis；lees；L(+)-tartaric acid；response surface methodology；extraction

TS262.91

A

1002-6630(2012)08-0049-05

2011-03-29

米思(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全。E-mail：babymisi@126.com

*通信作者：李華(1959—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槠咸雅c葡萄酒學(xué)。E-mail：lihuawine@nwsuaf.edu.cn