白守民 薛衛(wèi)平 劉宜敏 畢卓菲 梁碧玲

神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）是目前治療放射性腦損傷最有希望的方法之一。很多學(xué)者報(bào)道了用NSCs治療腦缺血、腦梗塞等，取得了一定的療效。NSCs治療放射性腦損傷是個(gè)復(fù)雜的過程，很多機(jī)理尚不清楚。其中，NSCs進(jìn)入腦組織后在腦內(nèi)的遷移，定向到達(dá)損傷部位，是干細(xì)胞治療腦損傷的基礎(chǔ)。本研究用SPIO標(biāo)記NSCs，磁共振（magnetic resonance，MR）活體示蹤干細(xì)胞在大鼠腦內(nèi)的遷移。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器

雄性健康（Sprague Dawley，SD）大鼠 30只，體重200 g。超順磁性氧化鐵納米顆粒SPIO(德國(guó) Schering 公司，1.4 ml /支，含鐵濃度0.5 mmol/ml，鐵顆粒直徑60 nm)；立體定位儀（深圳瑞沃德公司68001單臂型）；模擬定位機(jī)（東芝公司）；Siemens Primus直線加速器（西門子公司）；CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)賀利氏公司）；倒置相差顯微鏡；Philips Intera 1.5T MR掃描儀；大鼠專用線圈（上海辰光公司）；NSCs完全培養(yǎng)基（廣州金葉公司）。

二、NSCs的培養(yǎng)及鑒定

斷頸處死SD母鼠，75﹪酒精浸泡數(shù)分鐘，用眼科剪在腹部的中間位置橫切，剪開腹部皮膚，充分暴露母鼠的腹膜，剪開腹膜，可見胎鼠。將胎鼠逐個(gè)分離出來，并轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)裝有磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）的培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下無菌去除腦膜，分離胎腦，將分離出來的胎腦移入裝有NSCs完全培養(yǎng)基的離心管中，吹打，直至胎腦解離成單細(xì)胞懸液。將解離好的單細(xì)胞懸液移入T25培養(yǎng)瓶中，一個(gè)胎腦接種一個(gè)T25培養(yǎng)瓶，將T25培養(yǎng)瓶放回37℃?CO2培養(yǎng)箱中。當(dāng)NSCs出現(xiàn)神經(jīng)球較大和NSCs出現(xiàn)貼壁分化的情況后，再對(duì)NSCs進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

NSCs?nestin抗原表達(dá)鑒定：吸取少量細(xì)胞懸液滴于晶多聚賴氨酸包被的載玻片上，培養(yǎng)2 h，使細(xì)胞黏附于載玻片上。用4﹪多聚甲醛+ 0.3﹪戊二醛固定15 min，計(jì)2次，5﹪正常山羊血清的PBS（含0.1﹪?Triton X-100）在37℃孵育30 min進(jìn)行封閉，吸去封閉液，加抗nestin多克隆抗體（1:200），4℃過夜。PBS漂洗3次，各 10 min，加二抗（1:500，山羊抗兔），37℃孵育45 min，吸去二抗反應(yīng)液，PBS漂洗3次，加染核試劑 Hochest，室溫孵育 30 min，PBS 洗 3次，熒光顯微鏡下觀測(cè)結(jié)果[1]。

三、放射性半腦損傷模型的制作

在模擬定位機(jī)下拍攝大鼠正位及側(cè)位照片，用不規(guī)則低熔點(diǎn)鉛制作右半腦照射的電子線擋塊及后半腦照射的光子線擋塊。電子線半腦模型采用6 Mev電子線垂直照射，源皮距100 cm，劑量率為300 Mu/min，照射深度為1.5 cm。光子線后半腦模型采用6 MV光子線側(cè)位照射，源皮距60 cm，照射深度為2.5 cm，體表加1 cm補(bǔ)償。取體重200 g的SD大鼠30只分為3組，10﹪的水合氯醛0.37 ml/100g麻醉大鼠，固定后行放療，第1組12只行電子線半腦照射，劑量為30 Gy；第2組12只行光子線后半腦照射，劑量為45Gy；第3組6只行光子線后半腦照射，劑量為55 Gy。

四、NSCs的體外標(biāo)記

硫酸魚精蛋白（PRO）為10 mg/ml，用蒸餾水稀釋為1 mg/ml備用。抽取30 μl的SPIO原液加入無血清培養(yǎng)液里，稀釋后備用，在24孔板中，取5孔先加入無血清培養(yǎng)液0.5 ml，按終體積為2 ml，預(yù)先加入總量PRO及不同體積的SPIO，使PRO 的終濃度為 4 μg/ml，在 37℃、5﹪CO2及飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中共同孵化過夜。12 h后，分別消化、離心各孔細(xì)胞備用。

五、NSCs的立體定向移植

同時(shí)獲取6瓶2代NSCs，計(jì)數(shù)后備用。按總體積5 ml在24孔板中，加入PRO及SPIO，使終濃度達(dá)到 PRO 為 4 μg/ml，SPIO 為 100 μg/ml。12 h后，分別消化、離心各瓶細(xì)胞，最后收集細(xì)胞，按5 × 105/10 μl備用。在放射性大鼠半腦損傷模型制作后7 h，各組大鼠麻醉后固定于大鼠立體定位儀上。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，以雙耳間線中點(diǎn)為0位。第1組，6只用右半腦照射大鼠，行左半腦移植，在大鼠左側(cè)半腦鉆孔（向前8.5 mm，左3 mm，深度5 mm），微量注射器注入細(xì)胞。第2組6只用后半腦45 Gy照射大鼠，在左前腦定位注入細(xì)胞。第3組6只用后半腦55 Gy照射大鼠，在左前腦定位。第4組6只用右半腦照射大鼠，為第1組對(duì)照組，植入未標(biāo)記SPIO的NSCs。第5組6只用后半腦45 Gy放射大鼠，為第2、3組對(duì)照組，注射未標(biāo)記SPIO的NSCs，每個(gè)大鼠植入的細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)細(xì)胞，體積為10 μl，用微量注射器抽取細(xì)胞后，按定位儀位置進(jìn)針，緩慢注入細(xì)胞，注射時(shí)間> 5 min，注射后留針5 min，緩慢拔針。

六、磁共振掃描成像

在移植后第 0、3、7、14、21和 27天進(jìn)行大鼠腦MR掃描。MR檢查序列：SE T1WI橫斷位、TSE T2WI橫斷位及矢狀位成像。T1WI的參數(shù)：TR/TE/采集次數(shù)(NSA)：300 ms/15 ms/1，層厚：2.0 mm；Vox 0.3 × 0.5。T2WI：TR/TE/采集次數(shù)(NSA)：1600 ms/50 ms/1，層 厚：2.0 mm；Vox：0.4 × 0.4；矩陣：512 × 512。

七、組織病理學(xué)及普魯士藍(lán)染色

分別在MR成像各時(shí)間點(diǎn)，各組取1只大鼠，取全腦行病理檢查。大鼠過量麻醉后，開胸，將灌洗針頭通過左心室插入升主動(dòng)脈，用500 ml生理鹽水、500 ml中性甲醛灌注后開顱取腦，石蠟包埋、切片，左半腦移植采用失狀位切片，后半腦移植采用冠狀位切片。常規(guī)蘇木精—伊紅染色及普魯士藍(lán)染色，光鏡下觀察標(biāo)記細(xì)胞的分布。

結(jié) 果

一、NSCs的培養(yǎng)及鑒定

最初培養(yǎng)的原代細(xì)胞大部分細(xì)胞呈球形聚集生長(zhǎng)，但細(xì)胞不均一，有較多單個(gè)散在細(xì)胞及絮狀組織。

傳代后的NSCs仍呈球形懸浮生長(zhǎng)，但雜細(xì)胞較少，背景較純，細(xì)胞球光亮透明，一般細(xì)胞傳至第二代即可用于實(shí)驗(yàn)研究。

NSCs?nestin抗原表達(dá)鑒定結(jié)果顯示，nestin表達(dá)陽性，說明該細(xì)胞符合NSCs的抗原特性。

二、大鼠放射性腦損傷模型的制作及立體定向移植

成功構(gòu)建大鼠左半腦及后半腦放射性腦損傷模型，30只大鼠無1例死亡。全部大鼠均順利移植，其中2只第2天出現(xiàn)腦膜炎癥狀死亡。全部大鼠在移植當(dāng)天開始使用頭孢呋辛鈉100 mg/只腹腔注射，連用3 d。

三、磁共振成像

在移植術(shù)后不同時(shí)間MR檢查的結(jié)果如下圖，1.5T MR可以清晰顯示大鼠腦內(nèi)植入的干細(xì)胞范圍，成像可以持續(xù)1個(gè)月以上。后半腦放射大鼠模型中，55 Gy放療組移植術(shù)后7 d就看到針孔局部向后突出的低信號(hào)影，移植術(shù)后14 d仍比較明顯（圖1 ）。右半腦放射大鼠模型中，移植術(shù)后27 d可以看到針孔局部向左側(cè)突出的低信號(hào)影（圖2）。

圖1 光子線劑量為55Gy，前半腦移植后第0、7、14天情況

圖2 光子線劑量為30Gy，右半腦照射移植后第1、12、27天照射情況

四、病理學(xué)檢查

不同時(shí)間大鼠經(jīng)組織切片及普魯士藍(lán)染色后，圖3顯示移植第14天，鐵標(biāo)記的細(xì)胞在腦組織內(nèi)存活，部分細(xì)胞向周邊擴(kuò)散。圖4顯示移植后第27天，在疏松的組織間隙可以看到少量分布的鐵標(biāo)記細(xì)胞。

圖3 光子線劑量為55Gy大鼠移植后第14天（×200）?

圖4 光子線劑量為55Gy大鼠第27天組織間隙標(biāo)記（×200）

討 論

將SPIO標(biāo)記的干細(xì)胞移植到活體內(nèi)，觀察干細(xì)胞在體內(nèi)的遷移已進(jìn)行了很多研究。正常情況下，干細(xì)胞移植到大鼠腦皮質(zhì)，細(xì)胞遷移很少或不遷移，Zhang等[2]將細(xì)胞注入到正常大鼠紋狀體后28 d，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞僅移動(dòng)1～1.5 mm。Jendelova等[3]沒發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞在正常大鼠腦內(nèi)的遷移，但在腦損傷發(fā)生時(shí)，移植的干細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出向損傷部位移動(dòng)的趨化性。腦缺血實(shí)驗(yàn)中，Hoehn等[4]以SPIO標(biāo)記的胚胎干細(xì)胞移植入大鼠腦缺血對(duì)側(cè)半球的皮質(zhì)下區(qū)和紋狀體，移植部位最初在MRI上是1個(gè)圓形的低信號(hào)區(qū)，數(shù)天后移植區(qū)內(nèi)側(cè)的胼胝體出現(xiàn)了線狀的低信號(hào)影，表明干細(xì)胞在向損傷側(cè)遷徙。在另一只鼠腦的3DMRI重建圖象上，明顯的看出干細(xì)胞于胼胝體內(nèi)由移植區(qū)向缺血半球遷徙。進(jìn)一步的研究現(xiàn)，干細(xì)胞的低密度影沿腦室壁呈線狀環(huán)繞，并向缺血半球側(cè)腦室的脈絡(luò)叢聚集，經(jīng)過紋狀體，最后到達(dá)缺血半球的皮層。本研究中，建立左右半腦及前后半腦的放射損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植后4周，移植入未放射左半腦的NSCs有向經(jīng)過放射的右半腦遷移的趨勢(shì)，注射針孔局部出現(xiàn)向右的低信號(hào)影。后半腦放射模型中，在前半腦注射干細(xì)胞后，MR也可以顯示注射部位局部有向后的低信號(hào)影，說明干細(xì)胞也有向后移動(dòng)的趨勢(shì)。55 Gy放射大鼠在移植后7 d就發(fā)現(xiàn)向后的低信號(hào)影，而45 Gy放射大鼠在27 d才發(fā)現(xiàn)向后的低信號(hào)影，似乎向后移動(dòng)的趨勢(shì)出現(xiàn)的時(shí)間與放射劑量相關(guān)，但還需要更多例數(shù)進(jìn)一步證明。本研究病理結(jié)果也發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞向組織遷移的趨勢(shì)，在針孔附近，靠近放射區(qū)域的疏松組織間隙可以發(fā)現(xiàn)少量的標(biāo)記細(xì)胞，但由于本單位實(shí)驗(yàn)條件限制，實(shí)驗(yàn)中很難將MR顯示遷移的部位在病理組織中準(zhǔn)確切片。另外，干細(xì)胞在腦內(nèi)移動(dòng)細(xì)胞的數(shù)量及距離，以及干細(xì)胞在腦組織內(nèi)的分化，還有待進(jìn)一步更精確的研究。SPIO示蹤NSCs在活體的遷移，為進(jìn)一步研究干細(xì)胞在微環(huán)境下的存活分化及治療機(jī)理提供了有益的幫助。

干細(xì)胞在體內(nèi)的趨化性及干細(xì)胞治療組織損傷的機(jī)制尚不完全清楚。大鼠放射性腦損傷模型的建立，目前沒有標(biāo)準(zhǔn)的方法，主要原因是大鼠腦對(duì)放射線耐受性較高，多數(shù)研究表明，25～30 Gy單次全腦大劑量放療后，一個(gè)月內(nèi)，大鼠基本無明顯放射性腦病的癥狀，病理檢查也沒有明顯的炎性改變[5]。但MRS可以在早期發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)代謝的改變，Movsas和官健等[6-7]的研究表明，放療后2周，MRS N-乙酰天門冬氨酸就出現(xiàn)了明顯的降低，說明在放射治療后，在腦超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化之前，腦內(nèi)的代謝已經(jīng)出現(xiàn)異常改變。本研究在放療后1周植入干細(xì)胞，高劑量組植入1周時(shí)就發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞的遷移，證明在放療后早期，大鼠腦內(nèi)就出現(xiàn)了炎性因子，引起干細(xì)胞的趨化作用，結(jié)果同MRS的研究基本一致。干細(xì)胞治療損傷的主要機(jī)理在于減少炎性因子分泌，穩(wěn)定溶酶體膜及減少凋亡等，如果損傷早期應(yīng)用干細(xì)胞治療是否能減少炎性因子分泌從而可以減少損傷程度，延長(zhǎng)出現(xiàn)損傷的時(shí)間，將是我們進(jìn)一步研究的內(nèi)容。

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4 Hoehn M, Kustermann E, Blank J, et al. Monitoring of implanted stem cellmigration in vivo:a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat[J]. Proc Natl Acad Sci 2002,99(25):16267-16272.

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