李懷平 王唯紅 孫緒丁

1.山東大學藥學院，山東濟南 250012；2.山東阿如拉藥物研究開發(fā)有限公司，山東濟南 250101

HPLC法測定藏藥安兒寧顆粒中巖白菜素的含量

李懷平1，2王唯紅1孫緒丁2

1.山東大學藥學院，山東濟南 250012；2.山東阿如拉藥物研究開發(fā)有限公司，山東濟南 250101

目的 建立測定安兒寧顆粒中巖白菜素含量的HPLC法。 方法 采用Boston C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為 25℃，以甲醇-水（17∶83，V/V）為流動相，流速為 1.0 mL/min，檢測波長為 275 nm，進樣量為 10 μL。 結(jié)果 在10.1～101.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，巖白菜素的色譜峰峰面積與對照品濃度線性關(guān)系良好（r=0.9998，n=5），平均加樣回收率分別為98.85%，RSD為1.37%（n=6）。 結(jié)論 所建立的含量測定方法簡便易行、準確度高、重現(xiàn)性好，可用于安兒寧顆粒中巖白菜素的質(zhì)量控制。

巖白菜素；安兒寧顆粒；HPLC；含量測定

安兒寧顆粒由天竺黃、短管兔耳草、巖白菜、高山辣根菜等九味藥材組方而成，具有清熱祛風、化痰止咳的功效，主要用于小兒風熱感冒、咳嗽有痰、發(fā)熱咽痛、上呼吸道感染見上述癥候者[1]。方中君藥巖白菜為民間常用藥，最早記載于清《分類草藥性》，具有滋補、止血、止咳等功效[2-3]。巖白菜素為巖白菜主要藥效成分，具有收斂止瀉、止血止咳、舒筋活絡的功效，生理活性顯著，為鎮(zhèn)咳祛痰藥之良藥，多用于民族藥中肺系統(tǒng)疾病及消化道系統(tǒng)疾病的治療[4-6]，因此選取巖白菜素作為安兒寧顆粒含量測定指標。文獻報道巖白菜素的含量測定方法主要有紫外分光光度法[7-8]、薄層掃描法[9-10]和高效液相色譜法[11-13]。本實驗采用高效液相色譜法（HPLC）對安兒寧顆粒中巖白菜素進行了含量測定，并對其進行了方法學研究。本文首次建立了安兒寧顆粒中巖白菜素的含量測定方法，該方法簡便易行，專屬性強，穩(wěn)定性、重復性較好，精密度、回收率也較高，因此能夠作為安兒寧顆粒中巖白菜素的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1220型安捷倫高效液相色譜儀；BostonC18色譜柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；BT125D 賽多利斯電子分析天平，KQ-300B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

巖白菜素對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用），批號：111532-200202；安兒寧顆粒（青海金訶藏藥藥業(yè)股份有限公司）， 批 號 分 別 為 20091005、20091110、20091227，規(guī)格：3 g/袋；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 液相色譜條件

色譜柱：Boston C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：25℃，流動相：甲醇-水（17∶83，V/V），流速：1.0 mL/min，檢測波長：275 nm，進樣量：10 μL。理論板數(shù)按巖白菜素峰計算應不低于2000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取巖白菜素對照品12.62 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻；精密量取10 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得（巖白菜素含量為 50.48 μg/mL）。

2.2.2 供試品溶液的制備 本品研細后，取粉末2 g，精密稱定，置具塞的錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方量以相同制劑工藝制備缺少巖白菜藥材的陰性對照樣品，照“2.2.2”項下的供試品溶液的制備方法同法制得陰性樣品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性考察與陰性干擾試驗 照“2.1”項所述的液相色譜條件進行測定，精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各5 μL，分別注入液相色譜儀。試驗結(jié)果：供試品色譜中，在與對照品溶液色譜峰相應的位置上檢出相應的色譜峰，且?guī)r白菜素色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5；陰性對照溶液在與對照品溶液色譜峰相應的位置上沒有相應的色譜峰，表明陰性樣品對供試品的測定沒有干擾。結(jié)果見圖1。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取巖白菜素對照品溶液（101.0μg/mL）1、3、5、8、10 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，分別精密進樣10 μL注入高效液相色譜儀，照“2.1”項所述的液相色譜條件進行測定。以對照品濃度（C）為橫坐標，色譜峰峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線。試驗結(jié)果：巖白菜素回歸方程為A=6.0807C+0.4808，相關(guān)系數(shù)：R=0.9998。結(jié)果表明：巖白菜素在10.1～101.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，巖白菜素色譜峰的峰面積（A）與對照品濃度（C）線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗 照“2.1”項所述的液相色譜條件進行測定，精密吸取同一對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)測定6次，記錄巖白菜素色譜峰的峰面積并計算相對標準偏差。試驗結(jié)果：巖白菜素對照品色譜峰峰面積的平均值為310.3，RSD=0.53%（n=6）。結(jié)果表明：該方法儀器的精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 按照“2.2.2”項所述的方法制備供試品溶液，精密吸取同一供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，照“2.1”項所述的液相色譜條件進行測定，以后每隔2 h測定1次，考察8 h，記錄巖白菜素色譜峰的峰面積并計算相對標準偏差。試驗結(jié)果：供試品溶液中巖白菜素色譜峰峰面積的平均值為324.2，RSD=0.90%（n=5）。結(jié)果表明：供試品溶液中巖白菜素在8 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.3.5 重復性試驗 取同一批安兒寧顆粒樣品（批號為20091227）6份，按照“2.2.2”項所述的方法制備供試品溶液，照“2.1”項所述的液相色譜條件進行測定，分別精密吸取對照品溶液5、10 μL，供試品溶液 10 μL，注入液相色譜儀，測定，以外標兩點法方程計算含量。試驗結(jié)果：供試品溶液中巖白菜素含量的平均值為 3.954 mg/袋，RSD為1.15%（n=6）。結(jié)果表明：該分析方法重復性較好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批安兒寧顆粒樣品（批號為20091227，樣品中巖白菜素的含量為3.954mg/袋）1 g，共6份，分別置具塞的錐形瓶中，各精密加入對照品溶液（巖白菜素含量為 50.48 μg/mL）25 mL和 25 mL甲醇，按“2.2.2”項所述的方法制備供試品溶液，按“2.1”項所述的液相色譜條件進行測定，分別精密吸取對照品溶液5、10 μL，供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定，以外標兩點法方程計算含量，并計算回收率。試驗結(jié)果：供試品中巖白菜素平均加樣回收率為98.85%，RSD為1.37% （n=6）。結(jié)果表明：該測定方法測定結(jié)果準確。結(jié)果見表1。

2.3.7 樣品含量測定 按照“2.2.2”項所述的方法制備批號分別為20091005、20091110、20091227的三批安兒寧顆粒供試品溶液（每批3份）。按“2.1”項所述的液相色譜條件進行含量測定，分別精密吸取對照品溶液 5、10 μL，供試品溶液 10 μL，注入液相色譜儀，測定，以外標兩點法方程分別計算供試品中巖白菜素的含量。結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Table1 Results of the sample recovery rate（n=6）

3 討論

3.1 測定波長的選擇

取巖白菜素對照品溶液，置紫外分光光度計于190～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，記錄紫外吸收光譜圖。結(jié)果顯示巖白菜素對照品溶液在220 nm和275 nm有最大吸收峰，分別以220 nm和275 nm作為檢測波長進行考察，結(jié)果表明275 nm波長下供試品色譜圖中基線平穩(wěn)，雜質(zhì)峰較少，分離度效果好。文獻報道巖白菜素含量測定也多采用275 nm[12-16]，因此選定275 nm為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

參照相關(guān)文獻對流動相進行考察，發(fā)現(xiàn)不需加入酸液或緩沖液即可獲得良好的色譜峰，文獻多采用甲醇-水系統(tǒng)[12-16]，因此選擇了甲醇-水系統(tǒng)為流動相。分別考察了甲醇-水（20∶80，V/V）、甲醇-水（17∶83，V/V）、甲醇-水（15∶85，V/V）流動相條件下，供試品溶液中巖白菜素色譜峰的分離效果。結(jié)果表明，甲醇-水（15∶85，V/V）流動相條件下，巖白菜素峰保留時間較長；甲醇-水（20∶80，V/V）流動相條件下，巖白菜素峰形不好；甲醇-水（17∶83，V/V）流動相條件下，巖白菜素保留時間約15 min，峰形較好，巖白菜素色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于 1.5。因此選用甲醇-水（17∶83，V/V）為本實驗的流動相。

表2 安兒寧顆粒中巖白菜素含量測定結(jié)果（n=3）Table2 Results of content determination for bergenin in An'erning Keli（n=3）

3.3 供試品處理方法的考察

考察了超聲提取、回流提取、振揺提取3種提取方法，巖白菜素的提取效果，結(jié)果超聲提取所得供試品溶液中巖白菜素含量明顯高于回流提取和振揺提取，故選用提取方法為超聲提取；考察了超聲時間分別為20、30、40 min時，巖白菜素的提取效果，結(jié)果20 min提取不完全，30、40 min提取所得供試品溶液中巖白菜素含量無明顯差別，故選擇超聲時間為30 min；選擇提取溶劑時分別考察了甲醇、50%甲醇、95%乙醇3種溶劑，結(jié)果甲醇作為提取溶劑時所得供試品溶液中巖白菜素含量最高，故選擇提取溶劑為甲醇。

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Determination of bergenin in An'erning Keli by HPLC

LI Huaiping1,2WANG Weihong1SUN Xuding2
1.Shandong University School of Medicine,Ji'nan 250012,China;2.Shandong Arura Pharmceutical Research&Development Limited Co.,Ltd.,Ji'nan 250101,China

ObjectiveTo establish HPLC method for determination of bergenin in An'erning Keli.MethodsThe content of bergenin in An'erning Keli was determined by HPLC on a Boston C18column (250 mm×4.6 mm,5 μm)with the column temperature at 25℃.The mobile phase,a solution of methol and water(17∶83,V/V),was set at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 430 nm,and the injection volume was 10 μL.ResultsThe determination of bergenin kept the good linearity relation in the content range of 10.1-101.0 μg/mL(r=0.9998,n=5).The mean sample recovery rate of bergenin was 98.85%,and the RSD was 1.37%(n=6).ConclusionThe established method for determination of bergenin is simple,accurate with good reproducibility,which can be qualified for the quality control of bergenin in An'erning Keli.

Bergenin;An'erning Keli;High performance liquid chromatography;Content determination

R286

A

1674-4721（2012）10（c）-0066-03

2012-07-11 本文編輯：郭靜娟）