何 強(qiáng)，孔祥虹，李建華，樂愛山，吳雙民

(陜西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，陜西西安710068)

濃縮石榴汁中熊果苷的超高效液相－串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法研究

何 強(qiáng)，孔祥虹，李建華，樂愛山，吳雙民

(陜西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，陜西西安710068)

建立了濃縮石榴汁樣品中熊果苷含量測定的固相萃?。咝б合啵?lián)質(zhì)譜測定方法。樣品用水稀釋，HLB和氨基固相萃取柱凈化，采用BEH Amide色譜柱(100mm×2.1mm，1.7μm)分離，以乙腈和水梯度洗脫，多反應(yīng)監(jiān)測模式測定，定量離子對為m/z 271.2＞108.0，定性離子對為m/z 271.2＞160.9，外標(biāo)法定量。熊果苷的檢測限為0.006mg/kg，在0.004～0.2mg/L濃度范圍內(nèi)，熊果苷的線性相關(guān)系數(shù)為0.9994，熊果苷的加標(biāo)回收率均在80.6%～108.1%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于8.3%。該方法樣品凈化效果良好，檢測簡便、快速、準(zhǔn)確，能夠滿足濃縮石榴汁中熊果苷含量測定和定性確證的要求。

濃縮石榴汁，熊果苷，固相萃取，超高效液相－串聯(lián)質(zhì)譜

果汁摻假是果汁生產(chǎn)行業(yè)的一種不法行為，利用價(jià)格較低的水果或果汁摻入到價(jià)格高的水果原料果或果汁中是一種已被曝光的違法行為，在鑒偽技術(shù)方面已有較多的研究［1］，但對濃縮石榴汁的摻偽鑒別研究較少，由于石榴汁的價(jià)格遠(yuǎn)高于梨汁，如何鑒別石榴汁中摻入梨汁對于辨別石榴汁的純正性，維護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益具有重要意義。熊果苷是梨果實(shí)中的一種特征成分［2］，而石榴中尚未見有關(guān)于熊果苷的文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中也未從石榴中檢出熊果苷成分，所以利用檢測熊果苷這一特征成分來鑒別石榴汁中是否摻入梨汁是一種可行的方法。目前濃縮石榴汁中熊果苷的檢測方法研究較少，相關(guān)方法主要是化妝品和中草藥中熊果苷的檢測，主流方法是高效液相色譜法［3－7］及液相色譜質(zhì)譜法［8－10］，另外薄層色譜法［11］、毛細(xì)管電泳法［12］、氣相色譜－質(zhì)譜法［13］、電化學(xué)法［14－15］等也有相關(guān)報(bào)道，文獻(xiàn)報(bào)道的高效液相色譜法及液相色譜－質(zhì)譜法均采用反向色譜柱分離熊果苷，而由于熊果苷極性較大，流動(dòng)相需要高比例的水相，抑制熊果苷質(zhì)譜檢測時(shí)的電離，而且分離效果不佳。本研究利用HLB柱和氨基柱組合固相萃取的方法提高樣品凈化效果，選擇新型BEH Amide色譜柱進(jìn)行樣品分離以提高分離效果及靈敏度，選擇超高效液相－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測以實(shí)現(xiàn)定量分析與定性確證同時(shí)進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

濃縮石榴汁 均為送檢樣品;熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司;乙腈、甲醇(HPLC級(jí)) 德國MERCK公司;無水硫酸鈉 分析純，天津市津北精細(xì)化工有限公司(使用前于650℃灼燒4h);水為超純水 美國Millipore公司，Milli－Q超純水凈化系統(tǒng)制備。

Oasis HLB固相萃取柱(200mg，6cc)、Sep－Pak Vac NH2固相萃取柱(200mg，6cc) 美國Waters公司;AcquityTM超高效液相色譜儀 配Quattro Premier XE串聯(lián)質(zhì)譜儀、電噴霧電離(ESI)接口，美國Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 將熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解配制成1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱保存，標(biāo)準(zhǔn)使用溶液用乙腈逐級(jí)稀釋。

1.2.2 供試品溶液的制備 稱取5g(精確至0.01g)試樣置于50mL離心管中，加入約20mL水，振搖混勻，定容至25.0mL。將HLB固相萃取柱依次用5mL甲醇、10mL水活化，準(zhǔn)確移取5mL試樣溶液上樣，控制流速2～3mL/min，待樣品溶液流完后，減壓抽干20min，在NH2固相萃取柱上端裝填約2cm高的無水硫酸鈉，并用5mL乙腈活化后串接在抽干的HLB柱下方，用12mL乙腈淋洗，控制流速約2mL/min，棄去流出液，去掉HLB固相萃取柱，將NH2柱再用15mL乙腈－甲醇(1∶1，v/v)洗脫，洗脫液于40℃水浴中減壓濃縮至干，用5.00mL乙腈溶解定容，過0.2μm有機(jī)微孔濾膜，供液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測定和確證。

1.2.3 測定條件 ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(100mm×2.1mm，1.7μm);柱溫35℃;流動(dòng)相采用乙腈－水梯度洗脫，首先在1.0min時(shí)間內(nèi)，乙腈保持95%，然后在1.0～5.0min乙腈由95%線性遞減至50%，水則由5%線性遞增至50%，最后在0.2min內(nèi)恢復(fù)到流動(dòng)相的初始比例，保持2min;流速0.2mL/min;進(jìn)樣量2μL。

離子源:電噴霧離子源;掃描方式:負(fù)離子掃描;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，定量離子對為m/z 271.2＞108.0，定性離子對為m/z 271.2＞160.9;毛細(xì)管電壓3kV;萃取電壓3V;錐孔電壓30V;定量離子和定性離子的碰撞能量分別為25、10eV;離子源溫度110℃;脫溶劑溫度400℃;脫溶劑氣流量:500L/h;錐孔氣流量50L/h;碰撞室氬氣流量0.2mL/min(真空度約3×10－5MPa);四級(jí)桿分辨率為15.0。

1.2.4 方法適用性實(shí)驗(yàn) 對線性關(guān)系、檢出限、儀器精密度、方法重現(xiàn)性、加標(biāo)回收率等進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)考察。

1.2.4.1 線性關(guān)系 配制濃度為0.004、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2mg/L熊果苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.3規(guī)定的色譜－質(zhì)譜條件進(jìn)樣檢測，并以標(biāo)準(zhǔn)濃度(X， mg/L)為橫坐標(biāo)，定量離子離子流圖的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)作圖，同時(shí)用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，考察方法的線性關(guān)系。

1.2.4.2 檢出限 取含有熊果苷的濃縮石榴汁樣品溶液稀釋進(jìn)樣，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，按3倍信噪比計(jì)算檢出限，按10倍信噪比計(jì)算最低定量限。

1.2.4.3 儀器精密度、方法重現(xiàn)性 取濃度為0.02mg/L的熊果苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄定量離子對離子流圖的峰面積，計(jì)算峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察儀器的精密度。取含有熊果苷的濃縮石榴汁樣品按照1.2.2的方法平行處理6份，進(jìn)樣檢測，計(jì)算測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的重現(xiàn)性。

1.2.4.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 取不含熊果苷的濃縮石榴汁樣品進(jìn)行，每個(gè)樣品添加0.1、0.2、0.4mg/kg三個(gè)水平的熊果苷，每個(gè)添加水平重復(fù)10次，計(jì)算回收率及回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 凈化條件的考察

由于熊果苷的極性較大，而且不具有離子化的特性，復(fù)雜樣品中微量熊果苷的提取凈化一直是個(gè)難題，相關(guān)研究也較少。本實(shí)驗(yàn)將濃縮石榴汁用水稀釋后過固相萃取柱，熊果苷在C18、NH2、PSA、MCX、MAX等固相萃取柱上基本都沒有保留，在活性炭固相萃取柱上也僅有較少的保留，而HLB柱(200mg，6cc)對熊果苷有較好的吸附作用，但對濃縮石榴汁中的主成分糖類物質(zhì)基本沒有吸附，所以選擇HLB柱可以有效去除糖類等物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同規(guī)格的HLB柱對果汁中熊果苷的吸附作用差別較大，60mg、3cc的HLB柱對果汁中的熊果苷的回收率僅約30%左右，可能是由于60mg的HLB柱吸附量較小，容易超載而造成回收率差。

接著考察了HLB柱、HLB柱串聯(lián)NH2柱、HLB柱串聯(lián)PSA柱等幾種情況，僅用HLB柱凈化不完全，在質(zhì)譜檢測時(shí)容易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，HLB柱串聯(lián)PSA柱對一些低極性雜質(zhì)的去除效果不理想，而HLB柱串聯(lián)NH2柱可以通過改變淋洗及洗脫條件，有效去掉果汁中的干擾雜質(zhì)，所以最終選擇HLB柱串聯(lián)NH2柱進(jìn)行樣品凈化。

利用凈化后的空白濃縮石榴汁樣品溶液配制熊果苷的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，并與相同濃度的熊果苷標(biāo)準(zhǔn)溶液相比較，分別重復(fù)進(jìn)樣3次、6次測定質(zhì)譜響應(yīng)值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.8%，可判斷經(jīng)樣品凈化及色譜分離后，濃縮石榴汁樣品對熊果苷基本不存在質(zhì)譜基質(zhì)效應(yīng)。

2.2 測定條件的優(yōu)化

首先采用毛細(xì)管進(jìn)樣模式對熊果苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜檢測條件進(jìn)行了考察，由于熊果苷化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)羥基，適合采用負(fù)離子模式進(jìn)行檢測，首先比較了電噴霧負(fù)離子模式(ESI－)和大氣壓化學(xué)電離負(fù)離子模式(APCI－)，發(fā)現(xiàn)熊果苷在ESI－模式下的響應(yīng)值較高，所以選用ESI－模式進(jìn)行測定，然后在毛細(xì)管連續(xù)進(jìn)樣模式下對熊果苷的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以獲取最高的靈敏度，最終確定了1.2.3中的質(zhì)譜條件。

接著對色譜條件進(jìn)行了考察，比較了BEH C18、HSS T3、BEH Amide、BEH HILIC等色譜柱。其中BEH C18、HSS T3屬于反相色譜柱，熊果苷極性大，分離時(shí)需要高比例的水相，不利于熊果苷的質(zhì)譜電離，而且色譜出峰早，分離不夠理想;而BEH HILIC色譜柱對熊果苷基本沒有吸附;BEH Amide色譜柱對熊果苷的保留效果良好，而且流動(dòng)相采用高比例的有機(jī)相，便于質(zhì)譜電離及提高響應(yīng)值的穩(wěn)定性，流動(dòng)相中乙腈為90%時(shí)熊果苷的質(zhì)譜響應(yīng)值比流動(dòng)相中水為90%時(shí)提高20倍以上。

流動(dòng)相選擇時(shí)，考察了乙腈－水、乙腈－甲醇系統(tǒng)，由于乙腈－水系統(tǒng)的色譜峰形及保留特性優(yōu)于乙腈－甲醇系統(tǒng)，所以選擇乙腈－水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，而采用1.2.3的梯度洗脫條件，可以提高色譜分離效果，有效地降低樣品基質(zhì)效應(yīng)，熊果苷選擇離子對離子流圖如圖1所示，熊果苷定性離子對與定量離子對的豐度比約為82%。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子對(a)及定性離子對(b)的離子流圖Fig.1 MRM chromatograms of quantitative ion pair(a) and qualitative ion pair(b)

2.3 線性關(guān)系與檢出限

熊果苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=401.382X+ 5.08717，線性相關(guān)系數(shù)r為0.9994，線性關(guān)系良好。

濃縮石榴汁中熊果苷的最低檢出濃度為0.0012mg/L，最低定量濃度為0.004mg/L，根據(jù)樣品前處理方法換算，本方法的最低檢出限為0.006mg/kg，最低定量限為0.02mg/kg。

2.4 儀器精密度與方法重現(xiàn)性

濃度為0.02mg/L的熊果苷標(biāo)準(zhǔn)溶液6次測定峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%，儀器精密度良好。

平行處理的6份濃縮石榴汁樣品中熊果苷的測得量分別為1.85、1.76、1.92、1.69、1.81、1.75mg/kg，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.5%，重現(xiàn)性良好。

2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

加標(biāo)回收率及精密度數(shù)據(jù)如表1所示，回收率均在80.6%～108.1%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.9%～8.3%范圍內(nèi)，滿足檢測要求。

表1 回收率及精密度測定結(jié)果(n=10)Table 1 Results of recoveries and precisions(n=10)

2.6 樣品測定

利用本方法檢測了7批濃縮石榴汁樣品，僅1批濃縮石榴汁中未檢出熊果苷，其余樣品中檢出熊果苷含量在0.05～3.4mg/kg范圍內(nèi)，說明熊果苷在濃縮石榴汁中微量存在具有一定的普遍性，這些微量熊果苷可能來源于原料果中摻入的少量梨或果汁生產(chǎn)過程中的污染，由于本方法的靈敏度比已有方法提高10倍以上，也不能排除濃縮石榴汁中本身含有極微量的熊果苷，但在已有研究中未被檢測出來，需要進(jìn)一步的研究確認(rèn)。

3 結(jié)論

本方法采用HLB固相萃取柱結(jié)合氨基固相萃取柱提取凈化濃縮石榴汁中的熊果苷，并采用新型BEH Amide色譜柱分離熊果苷，取得了良好的效果。該方法樣品凈化過程采用兩種不同凈化機(jī)理的固相萃取柱相結(jié)合，凈化效果好，能夠有效地去除干擾組分，利用BEH Amide色譜柱的分離效果良好，而且可以保證熊果苷在高比例有機(jī)相條件下電離，與已有的檢測方法［9］比較，在進(jìn)樣量減少2.5倍的情況下，仍可以提高熊果苷的檢測靈敏度10倍以上。

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Study on detection method of arbutin in pomegranate juice concentrates by ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry

HE Qiang，KONG Xiang－h(huán)ong，LI Jian－h(huán)ua，YUE Ai－shan，WU Shuang－min
(Technical Center，Shaanxi Entry－exit Inspection and Quarantine Bureau，Xi’an 710068，China)

A method was developed for the determination of arbutin in pomegranate juice concentrate by solid phase extraction(SPE)and ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry(UPLC－MS/ MS).Samples were diluted by water and then cleanup with HLB and aminopropyl SPE columns.UPLC was performed on a BEH Amide column(100mm×2.1mm，1.7μm)using a gradient acetonitrile－water system as mobile phase，and MS/MS was performed with multiple reation monitoring(MRM)mode using m/z 271.2＞108.0 as quantitative ion pair and m/z 271.2＞160.9 as qualitative ion pair.Quantitation was carried out using an external standard method.The detection limit of arbutin was 0.006mg/kg and the calibration curves were linear at the range of 0.004～0.2mg/L with linear correlation coefficient as 0.9994.The recoveries ranged from 80.6%to 108.1%with relative standard deviations less than 8.3%.The results of sample cleanup were well，and the determination method was simple，fast and sufficient.It was suitable for quantitative and qualitative analysis of arbutin in pomegranate juice concentrate.

pomegranate juice concentrate;arbutin;solid phase extraction;ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry

TS255.7

A

1002－0306(2012)10－0062－04

2011－08－16

何強(qiáng)(1980－)，男，碩士，高級(jí)工程師，主要從事食品檢測技術(shù)方面的研究。

陜西省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2010K01－19－4);國家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目(2009IK285);陜西出入境檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目(2010IK001)。