樊 倩，韋慶益，袁爾東，江 洪，曾素瀅，寧正祥，*，高建華

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，湖北武漢430700)

植物中酪氨酸酶的篩選及不同抑制劑對(duì)其活性的影響

樊 倩1，韋慶益1，袁爾東1，江 洪2，曾素瀅1，寧正祥1，*，高建華1

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，湖北武漢430700)

以新鮮馬鈴薯、紅富士蘋(píng)果、紅蛇果、秀珍菇和紫茄子為研究對(duì)象，從中分別提取酪氨酸酶并測(cè)定其酶活力，發(fā)現(xiàn)紫茄子中提取的酪氨酸酶具有最大酶活力。因此選紫茄子中提取的酪氨酸酶做進(jìn)一步研究。選鄰苯二酚作為茄子酪氨酸酶底物，進(jìn)一步研究了有機(jī)類(lèi)、無(wú)機(jī)類(lèi)和天然類(lèi)三大類(lèi)抑制劑對(duì)酪氨酸酶催化活性的影響，并測(cè)定了這些抑制劑的IC50值。

酪氨酸酶，提取，抑制劑

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮土豆、紅富士、紅蛇果、秀珍菇、紫茄子 當(dāng)?shù)厥袌?chǎng);牛血清蛋白 Roche公司;肉桂酰甘氨酸甲酯(a1)、肉桂酰甘氨酸乙酯(a2)、肉桂酰甘氨酸丙酯(a3)、肉桂酰甘氨酸正丁酯(a4)、肉桂酰苯丙氨酸乙酯(b1)、阿魏酰苯丙氨酸乙酯(b2) 本實(shí)驗(yàn)室按照文獻(xiàn)［6］合成;二氫楊梅素、蘆丁 陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司;焦磷酸鈉、亞硫酸氫鈉 分析純;鄰苯二酚 南京化學(xué)試劑有限公司;DMSO 廣州化學(xué)試劑廠(chǎng);其余實(shí)驗(yàn)室常用試劑 均為分析純。

低溫離心機(jī) 德國(guó)HETTICH公司;UV－1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析公司;其余為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)器材。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酪氨酸酶的提取 取植物材料25g按1∶2 (W/V)比例與冷的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(含20mmol/L抗壞血酸)混合，植物組織勻漿器勻漿2～3min，紗布過(guò)濾，濾液以 6500r/min低溫離心10min，棄去沉淀得粗酶提取液。測(cè)量上清液體積，留取1mL用于測(cè)定蛋白含量和酶活力。

1.2.2 鹽析及蛋白含量測(cè)定［7］以馬鈴薯粗提液為例。向馬鈴薯粗提液中加入不同飽和度的固體硫酸銨，飽和度分別為45%、55%、65%、75%。再以6000r/min離心20min，收集沉淀。將沉淀溶解在10mL上述緩沖溶液中。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定酶液的蛋白含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，于595nm處測(cè)定吸光度，做工作曲線(xiàn)，得到蛋白質(zhì)濃度與吸光度之間的關(guān)系，樣品蛋白質(zhì)濃度對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得。酶得率按照公式:酶得率(%)=純化酶活力/粗提酶活力×100%計(jì)算。

1.2.3 酶活力的測(cè)定 采用比色法。在含有0.93mL磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.8)的離心管中加入50μL、0.025mol/L的鄰苯二酚溶液，接著加入20μL酶液，迅速搖勻，在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)390nm處測(cè)定時(shí)間掃描值。使OD值變化量在0.1～0.4/min。按照公式:相對(duì)酶活力=OD值/蛋白含量計(jì)算酶的相對(duì)活力。

1.2.4 抑制劑對(duì)酪氨酸酶的抑制效果測(cè)定［8］1.5mL離心管中加入880μL pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液(0.1mol/L)和一定體積的樣品溶液(DMSO溶解)，用DMSO補(bǔ)齊至930μL，加入20μL酪氨酸酶溶液，于25℃恒溫靜置10min，加入50μL鄰苯二酚，迅速混勻，立即測(cè)定混合液在波長(zhǎng)390nm處吸光度隨時(shí)間變化的曲線(xiàn)。調(diào)整酶濃度，使吸光度的變化保持在每分鐘0.1個(gè)單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗酶液鹽析條件的確定

以馬鈴薯粗提酶為例。從圖1可以看出，當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到65%時(shí)，粗提酪氨酸酶液的純化酶得率達(dá)到了最大值，為89.94%。超過(guò)此飽和度，在75%時(shí)酶得率反而急劇下降，僅為39.31%。因此，選取飽和度為65%的硫酸銨用于鹽析純化各類(lèi)材料的粗提酶液。

圖1 不同飽和度的硫酸銨對(duì)粗酶液鹽析效果的影響Fig.1 Effect of ammonium sulfate with different concentrations on salting out of crude tyrosinase extract

2.2 相對(duì)酶活力的測(cè)定

從馬鈴薯、紅富士、紅蛇果、秀珍菇、紫茄子五種原料中提取酪氨酸酶的結(jié)果如表1所示。

幾種原料中，馬鈴薯提取物中蛋白含量最高，紫茄子次之，紅蛇果最低。相對(duì)酶活力數(shù)據(jù)顯示，其他四類(lèi)原料中提取的酪氨酸酶相對(duì)酶活力都比紫茄子低一個(gè)數(shù)量級(jí)。因此可以得到，紫茄子相對(duì)酶活力最高，最適宜作為提取酪氨酸酶的原料，選擇從紫茄子中提取的酪氨酸酶作為進(jìn)一步研究對(duì)象。

表1 幾種植物中提取的天然酪氨酸酶Table 1 Natural tyrosinase extracted from several plants

2.3 不同類(lèi)型的抑制劑對(duì)提取的酪氨酸酶活性的影響

2.3.1 有機(jī)類(lèi)抑制劑對(duì)酪氨酸酶活性的影響 由圖2可知，隨著抑制劑濃度的增大，酪氨酸酶活性有明顯降低趨勢(shì)。從表2中看出，對(duì)于前四種肉桂酰甘氨酸酯類(lèi)，他們對(duì)酪氨酸酶的抑制作用隨著氨基酸酯末端碳鏈的增長(zhǎng)而增強(qiáng)。他們能力的大小按如下順序排列:a4＞a3＞a2＞a1?？赡苁请S著碳鏈增長(zhǎng)，化合物的疏水性增強(qiáng)，這使得抑制劑本身與靠近酪氨酸酶活性中心的疏水區(qū)域結(jié)合的更加緊密。b1和b2則是由于苯環(huán)上取代基的不同而表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其順序是b2＞b1。我們推測(cè)，是由于苯環(huán)間位的羥基被甲氧基取代，從而使得化合物本身與酶或酶－底物復(fù)合物結(jié)合的更加緊密。至于b1的抑制作用沒(méi)有a2強(qiáng)的原因，則可能是因?yàn)槎呓Y(jié)構(gòu)中氨基酸基團(tuán)的不同，b1中的苯丙氨酸結(jié)構(gòu)明顯要比a2中的甘氨酸結(jié)構(gòu)占據(jù)更多的空間，這樣就形成了更大的空間位阻效應(yīng)，阻止了自身與酶的結(jié)合。我們之前曾用純酶研究了a1、a2、a3、a4、b1和b2等有機(jī)合成抑制劑對(duì)酪氨酸酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)抑制活性順序和IC50在數(shù)量級(jí)上與用天然酪氨酸酶粗提物研究的結(jié)果一致。

圖2 有機(jī)類(lèi)抑制劑對(duì)酪氨酸酶活性的影響Fig.2 Effect of organic inhibitors on tyrosinase activity

2.3.2 無(wú)機(jī)物質(zhì)對(duì)酪氨酸酶活性的影響 酪氨酸酶活性隨著這兩類(lèi)抑制劑濃度的增大而降低，其中亞硫酸氫鈉的抑制作用較弱。表2中結(jié)果顯示，亞硫酸氫鈉的IC50值約是焦磷酸鈉IC50的1.3倍。研究這兩類(lèi)無(wú)機(jī)鹽對(duì)酪氨酸酶活性的影響，可以為實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)提供一定的參考。

2.3.3 天然提取物對(duì)酪氨酸酶活性的影響 對(duì)比發(fā)現(xiàn)，蘆丁的IC50比二氫楊梅素要高出一個(gè)數(shù)量級(jí)，可見(jiàn)，二氫楊梅素對(duì)酪氨酸酶有較強(qiáng)的抑制作用。劉德育［10］等人也曾報(bào)道二氫楊梅素對(duì)酪氨酸酶有顯著的抑制作用，其IC50是0.082mmol/L。究其原因，可能是二氫楊梅素比蘆丁的分子結(jié)構(gòu)要小的多，這樣更有利于與酶或酶－底物復(fù)合物的結(jié)合;相反，蘆丁復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)造成了巨大的空間位阻，使其與酶或酶－底物復(fù)合物不易結(jié)合。

表2 各類(lèi)抑制劑抑制酪氨酸酶的IC50值Table 2 IC50values of different inhibitors on tyrosinase inhibition

3 結(jié)論

本文研究了天然酪氨酸酶的篩選及各類(lèi)抑制劑對(duì)天然源酪氨酸酶活性的影響。酪氨酸酶廣泛存在于動(dòng)植物、微生物體內(nèi)，對(duì)生物體各類(lèi)生命活動(dòng)、病變都有重要影響。研究酪氨酸酶及其抑制劑，對(duì)于醫(yī)療、美白、食品保鮮等領(lǐng)域，有著重要的指導(dǎo)意義。本文所研究的5類(lèi)提取酪氨酸酶的材料中，發(fā)現(xiàn)紫茄子所含的酪氨酸酶具有最理想的酶活力，因此是提取酪氨酸酶的最佳原材料。有機(jī)合成、無(wú)機(jī)鹽和天然提取物三大類(lèi)抑制劑中，有機(jī)合成的化合物對(duì)酪氨酸酶有最佳抑制效果，其中a3、a4、b2的IC50值分別為0.044、0.040、0.066mmol/L。天然提取的二氫楊梅素的IC50值也達(dá)到了0.068mmol/L。本文利用提取的天然源酪氨酸酶粗提物為基礎(chǔ)研究各類(lèi)抑制劑對(duì)其影響，可為酪氨酸酶抑制的初步篩選提供重要參考。

［1］Lee HS.Tyrosinase inhibitors of pulsatilla cernua root－derived materials［J］.J Agric Food Chem，2002，50:1400－1403.

［2］Shi Y，Chen QX，Wang Q，et al.Inhibitory effects of cinnamic acid and its derivatives on the diphenolase activity of mushroom (Agaricus bisporus)tyrosinase［J］.Food Chemistry，2005，92: 707－712.

［3］Jiménez M，Chazarra S，Escribano J，et al.Competitive inhibition of mushroom tyrosinase by 4－substituted benzaldehydes［J］.J Agric Food Chem，2001，49(8):4060－4063.

［4］孟鳳霞，高希武，張嵐，等.昆蟲(chóng)酪氨酸酶的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，2004，15(6):496－499.

［5］李好樣，李永耀，韓紅斐.蘋(píng)果中酪氨酸酶的提取及其催化活性研究［J］.太原師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008，7(4): 102－104.

［6］Wei QY，Jiang H，Zhang JX，et al.Synthesis of N－h(huán)ydroxycinnamoyl amino acid ester analogues and their free radical scavenging and antioxidative activities［J］.Med Chem Res，2011，DOI 10.1007/s00044－011－9713－2.

［7］張曉晴.香樟果實(shí)酪氨酸酶分離、純化和性質(zhì)分析［D］.無(wú)錫:江南大學(xué)，2008.

［8］巫曉琴.多功能維生素C衍生物的合成及生物活性測(cè)試［D］.廣州:中山大學(xué)，2007.

［9］Noh JM，Lee YS.Inhibitory activities of hydroxyphenolic acid－amino acid conjugates on tyrosinase［J］.Food Chemistry，2011，25:953－957.

［10］劉德育，雷煥強(qiáng).楊梅黃素及蛇葡萄素對(duì)酪氨酸酶的抑制作用［J］.生物化學(xué)雜志，1996，12(5):818－620.

Selection of tyrosinase from botany and the influence of different inhibitors on its activity

FAN Qian1，WEI Qing－yi1，YUAN Er－dong1，JIANG Hong2，ZENG Su－ying1，NING Zheng－xiang1，*，GAO Jian－h(huán)ua1
(1.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China; 2.Department of Chemistry，School of Science，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430700，China)

Fresh potatoes，Red Fuji apples，Red Delicious apples，Pleurotus geesteranus and purple eggplants were used，which tyrosinase was isolated and its enzyme activities were determined.Results showed that tyrosinase isolated from purple eggplants had the strongest activity.Consequently，tyrosinase of purple eggplants was chose to take further research，in which catechol was used as the substrate of tyrosinase.And the influence of three types of inhibitors organic，inorganic and natural inhibitors，on the catalytic activity of tyrosinase was discussed，while their IC50values were assayed.

tyrosinase;isolate;inhibitors

TS201.2+5

A

1002－0306(2012)10－0091－03

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一類(lèi)多功能酶，它不僅可以催化一元酚的羥基化反應(yīng)，還可以催化o－二元酚氧化成o－醌的反應(yīng)［1］。它的活性中心含有銅離子，這類(lèi)酶廣泛分布在微生物和動(dòng)植物體內(nèi)［2］。酪氨酸酶是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶，也是引起果蔬酶促褐變的主要因素［3］，同時(shí)也對(duì)昆蟲(chóng)的免疫及生長(zhǎng)有重要影響［4］。由于酪氨酸酶廣泛存在，因此在美白、保鮮、殺蟲(chóng)等方面有著良好的應(yīng)用前景。如今，人們已經(jīng)從微生物、植物及動(dòng)物體內(nèi)提取并純化了酪氨酸酶，對(duì)酪氨酸酶的研究主要集中在分離純化、催化機(jī)制、活性調(diào)控以及酪氨酸酶基因及其在生物體內(nèi)的生理作用等方面［5］。本文選取不同的果蔬，從中提取并篩選了具有最大活性酪氨酸酶的品種，進(jìn)而研究了不同的抑制劑對(duì)其抑制作用，這一研究可以為酪氨酸酶抑制劑的初步篩選提供重要參考。

2011－09－06 *通訊聯(lián)系人

樊倩(1987－)，女，在讀碩士，研究方向:酪氨酸酶抑制劑。

自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20702016);華南理工大學(xué)教學(xué)研究基金(Y1100100)。