吳 迪，邱 然，于春麗，江國(guó)金，*

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034; 2.中糧麥芽(大連)有限公司，遼寧大連116200; 3.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122)

制麥過(guò)程中麥芽抗氧化性的研究

吳 迪1，邱 然2，3，于春麗2，江國(guó)金2，*

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034; 2.中糧麥芽(大連)有限公司，遼寧大連116200; 3.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122)

大麥和麥芽中存在的氧化還原酶類能催化氧化總多酚、不飽和脂類等物質(zhì)，產(chǎn)生了一些風(fēng)味老化前驅(qū)物和羰醛化合物等，從而降低啤酒的非生物穩(wěn)定性和風(fēng)味穩(wěn)定性。研究了4個(gè)品種啤酒大麥在制麥過(guò)程中總多酚、老化前驅(qū)物及幾種氧化還原酶酶活力的變化，分析了制麥過(guò)程中總多酚、老化物質(zhì)含量的變化與氧化還原酶活力之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Prestige的抗氧化性最高，內(nèi)蒙大麥的抗氧化性最低，且DPPH自由基清除率和總多酚、TBA和LOX相關(guān)系數(shù)分別0.930和0.784具有高度相關(guān)性。

麥芽，氧化還原酶，總多酚，老化物質(zhì)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大麥 歐麥(Esterel、Prestige)，加麥(Metcalfe);國(guó)產(chǎn)內(nèi)蒙大麥 中糧麥芽(大連)有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉 沈陽(yáng)力誠(chéng)試劑廠;磷酸氫二鉀、硫代巴比妥酸、無(wú)水乙醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鉬酸鈉、乙二胺四乙酸、冰乙酸、無(wú)水乙酸鈉 沈陽(yáng)市華東試劑廠;30%雙氧水 沈陽(yáng)市聯(lián)邦試劑廠;羧甲基纖維素鈉 上海化學(xué)試劑廠;檸檬酸鐵胺 沈陽(yáng)新興試劑廠;氨水 沈陽(yáng)天罡化學(xué)試劑廠;亞油酸 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;二苯代苦味酰肼自由基(DPPH·) 分析純，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社;愈創(chuàng)木酚、Tween－20、鄰苯二酚，均為化學(xué)純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DLFU－W23050粉碎機(jī) 瑞士BUHILER;LB12糖化儀 德國(guó)LOCHNER;Delta320pH計(jì) 上海梅特勒－托利多公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;TU－1901雙光束紫外可見(jiàn)光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;微型制麥系統(tǒng) 德國(guó)SEEGER公司;恒溫恒濕培養(yǎng)箱 美國(guó)ThrmoFisherScie公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制麥工藝 浸麥和發(fā)芽溫度均為15℃，相對(duì)濕度為100%，浸麥過(guò)程:濕浸6h→干浸17h→濕浸4h→干浸4h(共31h)，發(fā)芽96h;發(fā)芽結(jié)束后進(jìn)入干燥過(guò)程:45℃3h→55℃4h→65℃4h→70℃4h→80℃1h。

1.2.2 酶液提取 稱取10g絕干麥芽，粉碎，放入糖化杯中，加入0.2mol/L的磷酸緩沖液(pH6.8)100mL于40℃水浴內(nèi)保溫?cái)嚢?100r/min)1h，過(guò)濾，所得濾液即為酶液，冷藏備用。

1.2.3 酶活力測(cè)定

1.2.3.1 CAT活性測(cè)定 參考文獻(xiàn)［6］。酶活力定義:在35℃下，65μmol/L過(guò)氧化氫為底物(pH7.8)，以每分鐘分解1μmol/L過(guò)氧化氫為1U。

1.2.3.2 POD活性測(cè)定 參考文獻(xiàn)［7］。酶活力定義:在25℃下，15mmol/L愈創(chuàng)木酚和4.4mmol/L過(guò)氧化氫為底物(pH6.0)，以3mL反應(yīng)液中每分鐘使A470增加0.1為1U。

1.2.3.3 LOX活性測(cè)定 參考文獻(xiàn)［8］。酶活力定義:在45℃下，2.53mmol/L亞油酸為底物(pH9.0)，以4.6mL反應(yīng)液中每分鐘使A234增加0.1為1U。

1.2.3.4 PPO活性測(cè)定 參考文獻(xiàn)［9］。酶活力定義:在35℃下，0.1mol/L鄰苯二酚為底物(pH4.6)，以3.3mL反應(yīng)液中每分鐘使A420增加0.1為1U。

1.2.4 協(xié)定糖化麥汁方法 參考文獻(xiàn)［10］。

1.2.5 抗氧化性的測(cè)定 總多酚測(cè)定參考文獻(xiàn)［11］;老化前驅(qū)物的測(cè)定參考文獻(xiàn)［12］;DPPH自由基清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)［13］。

2 結(jié)果與討論

2.1 制麥過(guò)程中氧化還原酶類的變化

如圖1所示，四個(gè)品種大麥在發(fā)芽0h(即浸麥結(jié)束)，除POD外，CAT、LOX、PPO活性都略有下降。隨著浸麥階段的吸水作用，大麥的呼吸作用加強(qiáng)，組織內(nèi)部發(fā)生了一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)［14］，此時(shí)氧化還原酶類被激活，浸麥結(jié)束后酶活逐漸升高，到發(fā)芽96h時(shí)，酶活達(dá)到最大值，較原大麥中的活力均有明顯提高，CAT為原大麥的2.2～31倍;POD為原大麥的6.5～15倍;LOX為原大麥的1.1～2.1倍;PPO為原大麥的1.5倍左右。

在發(fā)芽過(guò)程中，Prestige的CAT活力始終高于其他3個(gè)品種大麥，POD和LOX活性最低;國(guó)產(chǎn)大麥在發(fā)芽48h以后，POD、PPO活力最高，CAT活性最低。干燥后麥芽的部分酶類失活，麥芽中相應(yīng)的四種酶的活力均顯著下降，由于CAT、PPO對(duì)溫度敏感、熱穩(wěn)定性差，導(dǎo)致麥芽中CAT、PPO的活力較原大麥增幅不明顯。而LOX、POD活力與原大麥酶活相比，活力增加較多，POD為原大麥的3～4倍，LOX為原大麥的1.5～2倍。

圖1 制麥過(guò)程中氧化還原酶的變化(p＜0.05)Fig.1 Changes of oxidoreductases during malting(p＜0.05)

2.2 制麥過(guò)程中抗氧化性的變化

2.2.1 制麥過(guò)程中總多酚的變化 酚類化合物是主要的次生代謝物質(zhì)，其對(duì)大麥的風(fēng)味和抗氧化性質(zhì)有重要的影響。由圖2可以看出，不同品種的大麥中總多酚含量有所不同。在發(fā)芽0h，大麥中一部分酚類物質(zhì)溶于浸麥水中，四種大麥的總多酚含量都有所下降。在發(fā)芽階段，總多酚有不同程度的上升趨勢(shì)，到發(fā)芽 96h時(shí)四種麥芽的含量為 0.434～0.693mg/g，是原大麥的1.2倍左右。在干燥階段，高溫迫使氧化還原酶類、總多酚失活或者降解，導(dǎo)致麥芽中總多酚含量較發(fā)芽96h時(shí)有一定程度的下降。麥芽中總多酚含量較原大麥有所升高，是原大麥的1.1～1.5倍，其中Prestige的總多酚含量最高。

圖2 制麥過(guò)程中總多酚含量的變化(p＜0.05)Fig.2 Changes of total polyphenol during malting(p＜0.05)

2.2.2 制麥過(guò)程中老化前驅(qū)物的變化 TBA能準(zhǔn)確地測(cè)定羰基化合物(醛類物質(zhì))，與老化前驅(qū)物有較高的相關(guān)性，制麥過(guò)程中TBA的變化如圖3所示。在制麥過(guò)程中四個(gè)品種大麥TBA的變化趨勢(shì)相一致。在發(fā)芽0h，老化物質(zhì)很少或者還未產(chǎn)生，TBA值有下降的趨勢(shì)。在發(fā)芽階段，氧化還原酶被大量生成，產(chǎn)生大量LOX，此物質(zhì)能夠氧化不飽和脂肪酸，生成不穩(wěn)定的氫過(guò)氧化物，并能催化生成老化物質(zhì)－羰基化合物，使TBA值總體上升，在發(fā)芽96h時(shí)四個(gè)品種TBA值是原大麥的1.6～2.3倍。

圖3 制麥過(guò)程中TBA的變化(p＜0.05)Fig.3 Changes of TBA during malting(p＜0.05)

在干燥階段隨著溫度的升高，麥芽?jī)?nèi)部發(fā)生了復(fù)雜的美拉德反應(yīng)，促使還原糖和氨基化合物經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)，生成一些老化物質(zhì)，導(dǎo)致干燥階段麥芽TBA值較發(fā)芽階段有平緩的增加。不同品種原大麥的TBA值差別較小，但經(jīng)過(guò)浸麥、發(fā)芽、干燥工藝后，成品麥芽中TBA值的差別變大。其中麥芽Prestige較原大麥中TBA值僅升高了0.065，而國(guó)產(chǎn)大麥TBA值，升高了0.142，在四個(gè)品種中國(guó)產(chǎn)大麥TBA值含量最高，Prestige最低。

2.2.3 制麥過(guò)程中抗氧化物活性的變化 目前常用DPPH自由基清除率的方法評(píng)價(jià)麥芽的抗氧化力，清除率越大，其抗氧化力越強(qiáng)。四個(gè)品種大麥在制麥過(guò)程中DPPH自由基清除率的變化和它們之間的差異如圖4所示。在發(fā)芽過(guò)程中，四個(gè)品種的DPPH自由基清除率均有較平緩的上升趨勢(shì)，且在發(fā)芽96h時(shí)DPPH自由基清除率達(dá)到最大。在干燥階段麥芽總多酚含量有所降低(圖2)，而麥芽DPPH自由基清除率則繼續(xù)升高，說(shuō)明多酚并不是唯一的抗氧化物質(zhì)，還包括其他的非多酚化合物，如美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物。干燥后的麥芽DPPH自由基清除率為原大麥的1.1～1.2倍，其中Prestige的DPPH自由基清除率最高，Esterel和Metcalfe相差不大，國(guó)產(chǎn)大麥的最低。

圖4 制麥過(guò)程中DPPH自由基清除率的變化(p＜0.05)Fig.4 Changes of DPPH free radical during malting(p＜0.05)

2.3 氧化還原酶、總多酚、TBA、DPPH自由基清除率之間的相關(guān)性及相互作用

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，氧化還原酶、總多酚、老化前驅(qū)物、DPPH自由基清除率都是衡量大麥抗氧化性的指標(biāo)，它們之間具有一定的相關(guān)性。由圖5可以看出，DPPH自由基清除率和總多酚有極高的相關(guān)性γ=0.930、ρ=0.916(p＜0.01)，TBA和DPPH自由基清除率中度相關(guān)γ=0.404、ρ=0.440(p＜0.05)，TBA和 LOX高度相關(guān) γ=0.784、ρ=0.807(P＜0.01)。

圖5 氧化還原酶、總多酚、TBA、DPPH·清除率的相關(guān)性(p＜0.05)Fig.5 The correlation of redox enzymes、total polyphenol、TBA and DPPH free radical(p＜0.05)

隨著大麥籽粒在發(fā)芽過(guò)程中胚乳內(nèi)高分子化合物不斷溶解，內(nèi)源性氧化還原酶不斷被合成，并發(fā)生一系列反應(yīng)，其中POD以多酚和H2O2為底物，引發(fā)自由基鏈的連鎖反應(yīng)，而在O2存在的情況下PPO可以直接催化氧化多酚物質(zhì)生成醌類物質(zhì)，聚合后的多酚可與蛋白質(zhì)發(fā)生聚集作用，使蛋白質(zhì)親水基團(tuán)被多酚分子阻隔而形成沉淀物，使膠體平衡狀態(tài)被破壞，從而減弱麥汁的內(nèi)源性抗氧化力，對(duì)啤酒非生物穩(wěn)定性有較大影響。LOX可催化氧化不飽和脂肪酸產(chǎn)生老化物質(zhì)，同時(shí)氫過(guò)氧化物和羥自由基也可以直接與不飽和脂肪酸反應(yīng)生成脂肪酸氫過(guò)氧化物，隨后分解為老化物質(zhì)，使TBA升高。且在麥芽的焙焦階段發(fā)生一些復(fù)雜的反應(yīng)，如氨基酸與美拉德反應(yīng)過(guò)程中生成的二碳基化合物，經(jīng)過(guò)醛醇縮合反應(yīng)，形成長(zhǎng)鏈不飽和脂肪醛類，這些物質(zhì)對(duì)啤酒風(fēng)味有重要的影響作用。

總多酚的抗氧化作用由特殊的分子結(jié)構(gòu)－鄰酚羥基決定的，其不僅可以螯合金屬離子，抑制由金屬離子催化氧化或自由基反應(yīng);而且可以作為氫供體釋放出氫與自由基結(jié)合，自身形成相對(duì)穩(wěn)定的半醌自由基而中斷自由基鏈反應(yīng)，因此具有較強(qiáng)的抗氧化和DPPH自由基清除能力。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)制麥過(guò)程中4個(gè)品種大麥的總多酚、老化前驅(qū)物及幾種氧化還原酶酶活力的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在發(fā)芽過(guò)程中其變化趨勢(shì)基本一致，到發(fā)芽結(jié)束時(shí)數(shù)值均達(dá)到最大，經(jīng)高溫干燥后，麥芽中氧化還原酶類和總多酚含量有所降低，而TBA和DPPH自由基清除率有不同程度的升高，比較了四個(gè)品種麥芽的酶活力大小，Prestige＞Esterel＞Metcalfe＞國(guó)產(chǎn)，歐麥的抗氧化能力相對(duì)較高，可為大麥品種的選育和麥芽生產(chǎn)提供參考和借鑒;研究還發(fā)現(xiàn)DPPH自由基清除率與總多酚、DPPH自由基清除率與TBA、TBA與LOX都分別具有較強(qiáng)的相關(guān)性，因此POD、PPO、LOX酶活力可成為評(píng)估啤酒非生物穩(wěn)定性和風(fēng)味穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，而檢測(cè)麥芽中總多酚和DPPH自由基清除率可作為評(píng)價(jià)麥芽品質(zhì)的一種簡(jiǎn)單、快速的方法。

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Research of antioxidation of malt during making barley malting

WU Di1，QIU Ran2，3，YU Chun－li2，JIANG Guo－jin2，*
(1.College of Biology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China; 2.COFOC Malt(Dalin)Co.，Ltd.，Dalian 116200，China; 3.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Total polyphenol and unsaturated lipid could be oxidated by the oxidoreductases in barley and malt.The action of oxidoreductases could produce staling flavor precursors and carbonyl－aldehyde compounds，etc.which could lead to beer flavour deterioration.Researched changes of total polyphenol，staling precursors and oxidoreductases during malting of four varieties of beer barley，and analysised the relation of total polyphenol，staling precursors and oxidoreductases.Prestige with the maximum antioxidant activity and the inner monggol barley with the minimum antioxidant activity were found and a high correlation of between DPPH free radical and total polyphenol as well as between TBA and LOX were described and the correlation coefficient were 0.930 and 0.784 respectively.

malt;oxidoreductases;total polyphenol;staling substance

TS210.1

A

1002－0306(2012)10－0131－04

麥芽作為釀造的主要原料，其內(nèi)源性抗氧化性對(duì)麥汁和成品啤酒都有十分重要的影響。大麥和麥芽中含有具有催化作用的內(nèi)源性氧化還原酶(過(guò)氧化氫酶:CAT，過(guò)氧化物酶:POD，脂肪酸氧化酶: LOX，多酚氧化酶:PPO)和易被氧化的多酚、游離或酯化的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪和過(guò)氧化物等化合物［1］。在制麥過(guò)程中，內(nèi)源性氧化還原酶發(fā)生一系列的反應(yīng)，產(chǎn)生一些風(fēng)味老化的前驅(qū)物質(zhì)［2］，同時(shí)也消耗了一部分的內(nèi)源性抗氧化劑，如PPO能夠氧化多酚物質(zhì)，引發(fā)自由基鏈的連鎖反應(yīng)，聚合后形成紅色醌類物質(zhì);POD參與氧化交聯(lián)蛋白質(zhì)和可溶性戊聚糖，生成的產(chǎn)物可以導(dǎo)致麥汁和成品啤酒產(chǎn)生異味、引起非生物混濁、色澤改變等問(wèn)題［3－4］。另外，麥芽中酚類化合物及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物是兩個(gè)主要的內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)，它們具有清除自由基、抑制脂肪酸氧化酶、與部分金屬離子作用，在啤酒釀造中有延遲或阻止氧化的效果［5］。因此，為了促進(jìn)啤酒的內(nèi)源性抗氧化力防止啤酒因氧化變質(zhì)，人們開(kāi)始廣泛關(guān)注具有高抗氧化能力的原料。本文以大麥發(fā)芽過(guò)程中，內(nèi)源性氧化還原酶、總多酚、不飽和脂肪酸之間的相互作用為研究?jī)?nèi)容，通過(guò)分析制麥過(guò)程中大麥和麥芽的氧化還原酶、總多酚、老化前驅(qū)物之間的變化，建立相關(guān)的聯(lián)系，對(duì)提高麥芽抗氧化性，增強(qiáng)啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性和非生物穩(wěn)定性有重要意義。

2011－08－15 *通訊聯(lián)系人

吳迪(1987－)，女，碩士研究生，研究方向:麥芽制造理論及應(yīng)用。