段宙位，申鉉日，李 鵬，陳秀明，覃柳香

(海南大學食品學院，海南?？?70228)

羅非魚尾色素中抗氧化成分的提取及活性研究

段宙位，申鉉日*，李 鵬，陳秀明，覃柳香

(海南大學食品學院，海南海口570228)

為了研究魚尾色素的抗氧化性，以提取率和DPPH自由基清除率為評價指標，采用溶劑浸提的方法對色素進行提取，利用DPPH法、ABTS法和鐵氰化鉀還原法對提取物進行抗氧化實驗。結(jié)果表明，魚尾色素抗氧化成分提取的較佳工藝為浸提溶劑無水乙醇、溫度20℃、料液比(g/mL)1∶5、時間24h、浸提1次;此時色素提取物的提取率達2.40%，DPPH自由基清除率為58.44%?？寡趸詫嶒灡砻鳎~尾色素提取物具有較強的清除DPPH自由基和ABTS+自由基能力，其IC50值為0.3891mg/mL和1.8654mg/mL。

魚尾，抗氧化，提取，1，1－二苯基苦基苯肼(DPPH)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚尾 海南省?？谑腥缡称酚邢薰? 1，1－二苯基－2－三硝基苯肼DPPH Sigma公司; 2，2－聯(lián)氮－雙－(3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸)ABTS上海生工生物有限公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純;實驗用水 超純水。

TU－1901型雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;RE52－AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ－Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠; BS124S型電子天平 Sartorius公司;Alpha1－4lsc型冷凍干燥機 德國Christ公司;85－1型恒溫磁力攪拌器 常州澳華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚尾預處理 用冷水(4℃)清洗魚尾表面雜質(zhì)待用。

1.2.2 魚尾色素抗氧化成分提取的單因素實驗

1.2.2.1 魚尾抗氧化成分提取率的計算 將色素抗氧化成分提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮(35℃)，再經(jīng)真空冷凍干燥，得到固體干物質(zhì)，稱重，按下式計算提取率:

1.2.2.2 提取溶劑的選擇 取4.00g魚尾，放入分別盛有40mL甲醇、乙醚、氯仿、丙酮、乙醇、氯仿∶甲醇∶水=1∶2∶0.8、氯仿∶甲醇∶水=2∶1∶0.8的燒杯中，4℃浸提48h，按1.2.2.1方法計算提取率。配制濃度均為0.5mg/mL的色素溶液，按 1.2.4.1方法測定其對DPPH自由基的清除率。

1.2.2.3 提取溶劑體積分數(shù)的選擇 取4.00g魚尾，放入分別盛有40mL體積分數(shù)分別為10%、30%、50%、70%、90%乙醇和無水乙醇中，4℃浸提48h，按1.2.2.1方法計算提取率。配制濃度均為0.5mg/mL的色素溶液，按1.2.4.1方法測定其對DPPH自由基的清除率。

1.2.2.4 提取溫度的選擇 取4.00g魚尾，放入分別盛有40mL無水乙醇的燒杯中，分別于4、8、12、16、20、24℃水浴浸提48h，按1.2.2.1方法計算提取率。配制濃度均為0.5mg/mL的色素溶液，按1.2.4.1方法測定其對DPPH自由基的清除率。

1.2.2.5 料液比的選擇 取4.00g魚尾，分別加入12、20、40、60、80mL的無水乙醇溶液，在20℃條件下浸提48h，按1.2.2.1方法計算提取率。配制濃度均為0.5mg/mL的色素溶液，按 1.2.4.1方法測定其對DPPH自由基的清除率。

1.2.2.6 提取時間的選擇 取4.00g魚尾，加入20mL的無水乙醇，在20℃條件下分別浸提12、24、36、48、60h，按 1.2.2.1方法計算提取率。配制濃度均為0.5mg/mL的色素溶液，按 1.2.4.1方法測定其對DPPH自由基的清除率。

1.2.2.7 提取次數(shù)的選擇 取4.00g魚尾，加入20mL的無水乙醇，在20℃條件下分別浸提24h，提取次數(shù)超過兩次，合并提取液，按1.2.2.1方法計算提取率。配制濃度均為0.5mg/mL的色素溶液，按1.2.4.1方法測定其對DPPH自由基的清除率。

1.2.3 正交實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，運用L9(33)正交表，以魚尾色素提取物的提取率與清除率為指標，選擇溫度、料液比、時間進行三因素三水平正交實驗，因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels for the orthogonal design

1.2.4 抗氧化實驗

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的測定［8－10］取2mL不同濃度的樣品溶液，加入 2mL 6.5×10－5mol/L DPPH溶液，混合后在室溫下避光反應30min，以95%乙醇調(diào)零，在517nm處測其吸光度Ai;同時測定2mL 95%乙醇與2mL樣品溶液混合后的吸光度Aj以及2mL DPPH溶液與2mL 95%乙醇混合后的吸光度A0。

自由基清除率(%)=(1－(Ai－Aj)/A0)×100% 1.2.4.2 清除 ABTS+自由基的測定［11－12］取5.0mL 7mmol/L的ABTS溶液，加入88.0μL 140mmol/L的過硫酸鉀，在室溫下置于暗處反應12～16h，形成ABTS+自由基儲備液。在734nm處，用體積分數(shù)為70%的乙醇將ABTS自由基儲備液稀至吸光度為0.70±0.02，備用。準確量取0.1mL不同濃度(1、2、3、4、5mg/mL)的樣品溶液，加入3.9mL ABTS+溶液，混勻，在室溫下反應6min，于734nm處測定吸光度(AE)。同時吸取3.9mL ABTS+溶液，加入0.1mL 70%的乙醇溶液于734nm處測定吸光度(AB)。ABTS自由基清除率按下式計算:

ABTS自由基清除率(%)=(1－(AB－AE)/ AB)×100%

式中:AB空白樣吸光度;AE為試樣吸光度。

1.2.4.3 還原力的測定［13］在2.5mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液中加入不同濃度(0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8mg/mL)的樣品液2.5mL，1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混合均勻后在50℃恒溫20min，冷卻，再加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min離心分離10min，取上層清液5mL，加蒸餾水5mL和0.1% FeCl3溶液1mL，在700nm處測定吸光度。吸光度越高，還原能力越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚尾色素中抗氧化成分提取工藝研究

2.1.1 提取溶劑的選擇 由表2可知，隨著提取劑極性增加，色素抗氧化成分的提取率及其對自由基的清除率基本呈上升趨勢，說明魚尾色素中的抗氧化成分較易溶于極性較大的溶劑中。在以氯仿、甲醇、水的混合溶劑為提取劑時，色素的提取率高于其它提取溶劑，但其對自由基的清除率較乙醇低，且氯仿，甲醇毒性較乙醇大，考慮到自由基清除率、安全性、成本等因素，選擇無水乙醇作為提取溶劑。

2.1.2 提取溶劑體積分數(shù)的選擇 由圖1可知，當乙醇溶液體積分數(shù)增大時，色素的提取率及其對自由基的清除率隨之上升。這是可能是魚類色素主要由黑色素(黑色)、類胡蘿卜素(紅、黃等鮮艷的顏色)及嘌呤類物質(zhì)(銀白色)組成［13］，黑色素不溶于有機溶劑，嘌呤類物質(zhì)不具有抗氧化性，魚尾色素中的抗氧化成分應以類胡蘿卜素存在為主，而類胡蘿卜素又以脂溶性形式存在，由此表現(xiàn)出脂溶性溶劑提取率、清除率較高，因此選擇無水乙醇作為提取溶劑為宜。

2.1.3 提取溫度的選擇 由圖2可知，魚尾色素中活性成分的提取率隨溫度升高而增大，清除率略有降低，這可能是因為溫度升高色素的溶出增多，但對色素中抗氧化成分的結(jié)構(gòu)具有一定的破壞作用。綜合

考慮提取率、清除率及魚尾的再利用(提取高分子膠原蛋白，高分子膠原蛋白的變性溫度約為28℃)因素，提取溫度選擇20℃左右較為適宜。

表2 溶劑對色素提取率與自由基清除率的影響Table 2 Effect of different solvents on the extraction rate of pigment and the removal rate of free radical

圖1 乙醇體積分數(shù)對色素提取率與清除率的影響Fig.1 Effect of different concentration on the extraction rate of pigment and the removal rate of free radical

圖2 溫度對色素提取率與清除率的影響Fig.2 Effect of different temperatures on the extraction rate of pigment and the removal rate of free radical

2.1.4 料液比的選擇 由圖3可知，隨著料液比的減小，色素中抗氧化成分的提取率增大。當料液比(g/mL)低于1∶5時，提取率增加不明顯，這可能是料液比1∶5，色素的溶出基本達到平衡;當料液比小于1∶5時，提取率稍有增加，清除率略有降低，這可能是色素的溶出雖然增加，但抗氧化成分的溶出并未增加，同樣濃度的色素溶液，抗氧化成分的比例減少，清除率降低。料液比越小，溶劑的用量越大，考慮到清除率與成本因素，料液比選擇1∶5左右為宜。

2.1.5 提取時間的選擇 由圖4可知，隨著提取時間的延長，提取率隨之增加，當時間大于24h時，提取率增加趨勢變緩，清除率略有降低。這可能是時間增加，色素的溶出增多，但色素抗氧化成分在較長的時間里結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微變化，清除自由基能力略有降低，因此，提取時間選擇24h左右為宜。

2.1.6 提取次數(shù)的選擇 由表3可知，隨著提取次數(shù)的增加，提取率稍有增加，清除率變化不明顯?？紤]到增加提取次數(shù)會增加成本與延長實驗周期，選擇提取1次較為適宜。

圖3 料液比對色素提取率與自由基清除率的影響Fig.3 Effect of different elution liquid ratio on the extraction rate of pigment and the removal rate of free radical

圖4 提取時間對色素提取率與自由基清除率的影響Fig.4 Effect of time on the extraction rate of pigment and the removal rate of free radical

表3 浸提次數(shù)對色素提取率與自由基清除率的影響Table 3 Effect of the extraction times on the extraction rate of pigment and the removal rate of free radical

2.1.7 正交實驗 由表4可知，各因素對魚尾色素提取物提取率的影響次序為C＞B＞A，即時間＞料液比＞溫度。最優(yōu)水平為A3B2C2。這可能是溫度升高分子的運動加快，滲透和擴散速度加快;料液比減小液料的濃度差增大，分子的擴散速度加快;時間影響分子擴散體積，在較低溫度條件下，分子運動劇烈程度對色素擴散速度的影響不及料液比產(chǎn)生的濃度差，在較低擴散速度條件下，大量增加時間，對提高提取率作用顯著。各因素對DPPH自由基清除率的影響次數(shù)為C＞A＞B，即時間＞溫度＞料液比，最優(yōu)水平A2B3C2。這可能是在較低溫度條件下，色素提取物較穩(wěn)定，清除DPPH自由基能力主要受提取物中抗氧化成分所占比例的影響。由表4中極差值可知，各因素對清除率的影響的差異性相差不大，對提取率影響的差異性較大，這是因為色素提取物的抗氧化性主要受提取溶劑的影響，同種溶劑在不同條件下提取色素，主要會影響色素的溶出。因為2個指標獨立分析后得出的最佳提取條件不同，需要對各個指標的主次順序進行綜合考慮以確定最后的最佳工藝。由于本實驗的研究重點為產(chǎn)物的抗氧化性，即以DPPH自由基的清除率為主要考察指標，提取率對生產(chǎn)成本控制具有一定的參考價值。溫度對清除率影響較大，對提取率影響較小，水平A2與A3提取率僅相差0.013%，為保證清除率，溫度選擇A2較佳。料液比對清除率影響最小，水平B2與B3僅相差0.032%，對提取率影響較大，考慮到成本、提取率因素，料液比選擇B2最佳，時間均為C2最佳。

表4 正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Designs and results of orthogonal test

故根據(jù)正交實驗結(jié)果，在選定的浸提溶劑，提取次數(shù)條件下，最終確定魚尾色素抗氧化成分的提取工藝為A2B2C2，即溫度20℃、料液比1∶5，時間24h。對照正交表，正交實驗9組實驗中沒有A2B2C2，按A2B2C2條件補加實驗，重復三次取平均值，得色素提取物對DPPH自由基的清除率為58.44%，提取率達2.40%。

2.2 抗氧化活性的測定

2.2.1 DPPH自由基清除作用的測定 每個DPPH分子在溶液中可生成一個穩(wěn)定的含氮自由基，具有典型紫色，在517nm處有強吸收，當它與提供1個電子的自由基清除劑作用時，生成無色產(chǎn)物，使溶液的典型紫色變淺。由圖5可知，魚尾中抗氧化成分對DPPH自由基具有一定的清除能力，且隨質(zhì)量濃度的增加而增強。在低濃度實驗范圍0.2～0.4mg/mL內(nèi)，服從線性分布y=－8.965+151.55x，R2=0.998，其IC50值分別為0.3891mg/mL。

2.2.2 ABTS+自由基清除作用的測定 ABTS+經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基ABTS+·，加入提取物后，若該提取物具有抗氧化活性，則會與ABTS+·發(fā)生反應而使反應體系褪色［14］。由圖6可知，隨著濃度的增加，各提取物對ABTS+自由基的清除率也隨之增大，在實驗濃度范圍內(nèi)服從線性分布y =28.256+11.444x，R2=0.996，其IC50值1.8654mg/mL。

2.2.3 還原力的測定 許多研究表明［15－16］，抗氧化活性與還原力之間普遍存在相關(guān)性，可通過測定還原力來表示抗氧化活性的強弱，吸光度越高，還原能力越強。由圖7可知，魚尾色素提取物具有一定的還原能力，與自由基清除率相似，隨提取物質(zhì)量濃度的增加而增強。在實驗濃度范圍內(nèi)，服從線性分布y= 0.070+0.457x，R2=0.986。

圖5 提取物濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of extract concentration on rate of scavenging DPPH free radical

圖6 提取物濃度對ABTS+自由基清除率的影響Fig.6 Effect of extract concentration on rate of scavenging ABTS+free radical

圖7 提取物濃度對還原力的影響Fig.7 Effect of extract concentration on the reduction power

3 結(jié)論

通過單因素實驗，確定了各因素對魚尾色素中抗氧化成分的影響規(guī)律，選取因素水平值的理想范圍進行正交實驗及顯著性分析，確定了較佳的提取工藝為:浸提溶劑無水乙醇、溫度20℃、料液比(g/mL)1∶5、時間24h、浸提1次，此條件下色素提取物的提取率達2.40%，對 DPPH自由基清除率為58.44%?？寡趸钚詫嶒灡砻?，魚尾色素提取物具有較強的清除DPPH自由基和ABTS+自由基能力，且隨提取物質(zhì)量濃度增加而增強，其IC50值分別為0.3891mg/mL和1.8654mg/mL。還原力測定實驗也得出相似的結(jié)果。

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Study on the extraction of antioxidant components from Tilapia fishtail pigment and evaluation of their activities

DUAN Zhou－wei，SHEN Xuan－ri*，LI Peng，CHEN Xiu－ming，QIN Liu－xiang
(Collage of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，China)

The antioxidant activity compounds of fishtail pigment used ethanol as extraction solvent，was studied by means of extraction rate and DPPH free radical scavenging.Antioxidant activities of extract were evaluated by three different methods，such as DPPH and ABTS radical scavenging assay，potassium ferricyanide reduction method. The results showed that the better antioxidant components extraction conditions were extracted 1 time at 20℃ for 24h with solid－liquid ratio(g/mL)1∶5 by solvent ethanol.Under this condition，the antioxidant components extraction rate reached to 2.40%of the fish tail wet weight，and the clearance of DPPH free radicals was 58.44%.What’s more，the experiment of antioxidant activity showed that the extracted fishtail pigment presented the strong antioxidant activity to the DPPH and ABTS+radical，and their IC50were 0.3891mg/mL and 1.8654mg/mL，respectively.

fishtail;antioxidant;extraction;1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl(DPPH)

TS254.1

A

1002－0306(2012)10－0143－05

羅非魚(Oreochromis niloticus)又稱非洲鯽魚，屬鱸形目、鱺魚科。近年，我國羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，2009年羅非魚產(chǎn)量已達125.7萬t［1］，2010海南羅非魚總產(chǎn)量為26.7萬t［2］，其中羅非魚及其魚片的出口量占全國的40%，居全國第1位［3］。羅非魚在加工過程中產(chǎn)生大量的下腳料，包括魚頭、魚骨、魚鱗、魚尾和內(nèi)臟等，約占原料魚的40%～55%［4］，除小部分被用于生產(chǎn)飼料外，大部分被丟棄，造成了環(huán)境污染和資源的浪費。近年來，國內(nèi)很多研究部門圍繞羅非魚加工副產(chǎn)物的綜合利用進行了大量的研究，如羅非魚皮魚鱗膠原蛋白的提?。?］，羅非魚頭的利用［6］，羅非魚內(nèi)臟及魚骨的研究［7］等?？墒?，國內(nèi)外對羅非魚尾的利用研究較少，特別是對魚尾色素中抗氧化活性成分的研究少見報道。本實驗以羅非魚尾為研究對象，探討了羅非魚尾色素中抗氧化成分的提取方法及其抗氧化活性，旨在為魚尾色素的抗氧化利用提供理論基礎(chǔ)，進一步提高羅非魚加工副產(chǎn)物的利用價值。

2011－09－26 *通訊聯(lián)系人

段宙位(1985－)，男，碩士研究生，研究方向:水產(chǎn)品加工。

科技部科技人員服務(wù)企業(yè)行動項目(2009GJE20022);海南省自然基金項目(309007)。