馬立青，郭麗瓊，2，林俊芳，2，*，鄒毓琳

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系，廣東廣州510640; 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)能研究所，廣東廣州510640)

灰樹花固體發(fā)酵茶青的研究

馬立青1，郭麗瓊1，2，林俊芳1，2，*，鄒毓琳1

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系，廣東廣州510640; 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)能研究所，廣東廣州510640)

以茶青為發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)，對灰樹花固體發(fā)酵過程中的各種內(nèi)含物含量的變化及其品質(zhì)進行了研究。結(jié)果表明，灰樹花的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件:中葉茶，2%大豆粉，接種量1%，培養(yǎng)溫度25℃，培養(yǎng)時間9d。發(fā)酵后其菌質(zhì)的有效成分為:茶多酚1.78%，游離氨基酸0.77%，酚氨比2.3，多糖4.69%。與發(fā)酵前比較其多糖含量增加了31.7%，茶多酚降解了77.8%，游離氨基酸降低了26.7%，酚氨比降低了69.9%，茶葉品質(zhì)得到很大改善。

多糖，茶多酚，氨基酸，茶青

1 材料與方法

1.1 實驗材料

灰樹花菌株GF2號 本實驗室保存;茶青 選用茶樹品種金萱的嫩葉(一芽四葉)、中葉(五到七葉)、老葉(七葉以上)為材料，采摘于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)寧西教學(xué)基地，蒸汽殺青、干燥備用;大豆 輔料，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院贈送;土豆、玉米、麩皮、蕎麥、燕麥、大米 輔料，均為市售;土豆用30倍量的沸水煮30min取濾液，玉米等粉碎并過60目篩;馴化培養(yǎng)基3%金萱中葉茶青，97%PDA固體培養(yǎng)基;茶固體培養(yǎng)基 茶青添加量為35%，輔料添加量為2%，自然pH。

表1 不同老嫩度茶青對菌質(zhì)活性成分及灰樹花生長速度的影響Table 1 Effect of old tender degree on the active ingredient of fungal substance and the growth rate of Grifola frondosa

表2 不同輔料對菌質(zhì)活性成分及灰樹花生長速度的影響Table 2 Effect of different excipients on the active ingredient of fungal substance and the growth rate of Grifola frondosa

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種馴化及固體發(fā)酵 從母種斜面上接約0.5cm2大小的菌塊到馴化培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)7d，制得馴化菌種;取1%的馴化菌種接到茶固體培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)9d，收集菌質(zhì)置于60℃干燥箱內(nèi)烘干，磨碎過60目篩。

1.2.2 實驗設(shè)計

1.2.2.1 灰樹花固體發(fā)酵不同老嫩度茶青的研究將嫩葉、中葉、老葉分別按35%的量與2%的大豆混勻，含水量為63%，25℃恒溫培養(yǎng)9d，收集菌質(zhì)烘干待測，共3個處理，每個處理3個重復(fù)。

1.2.2.2 不同輔料對灰樹花固體發(fā)酵基質(zhì)的影響將大豆、土豆、玉米、麩皮、蕎麥、燕麥、大米各按2%分別添加到中葉培養(yǎng)基中，其他條件不變，共7個處理，每個處理3個重復(fù)。

1.2.2.3 灰樹花固體發(fā)酵茶青過程的內(nèi)含物質(zhì)的變化 35%的中葉與2%的大豆混勻，其他條件不變，以接種時為起點，在之后的0，3，6，9，12，15，18，21，24d取樣烘干測定各活性成分，每次3個重復(fù)。

1.2.3 茶多酚的測定 Folin試劑比色法(GB/T8313－2008)。

1.2.4 游離氨基酸總量的測定 按參考文獻［9］進行測定。

1.2.5 多糖的測定 按參考文獻［10］的方法進行測定。

1.2.6 三萜的測定 稱取0.25g的茶菌質(zhì)，加40mL無水乙醇用超聲波處理1h，溫度控制在8℃左右，然后過濾收集濾液，定容至50mL。測定方法參考文獻［11－12］略作修改。

1.2.7 酚氨比的計算 酚氨比=茶多酚總量/游離氨基酸總量。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行方差分析，實驗數(shù)據(jù)以平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰樹花固體發(fā)酵不同老嫩度茶青的研究

茶青的老嫩程度不同，其內(nèi)在化學(xué)物質(zhì)含量不同，對藥食用菌固體發(fā)酵有一定的影響。如表1所示，發(fā)酵后，中葉多糖含量最高，顯著高于老葉，與嫩葉無顯著性差異;三萜隨著茶青老化而顯著增加;茶多酚、氨基酸、酚氨比隨茶青的老化而降低;中葉的生長速度最快，與嫩葉、老葉呈極顯著性差異，可能由于嫩葉中茶多酚含量較多，抑制了灰樹花的生長，同時，由于嫩葉基質(zhì)質(zhì)地幼嫩，木質(zhì)素、纖維素等含量相對較低［13］，培養(yǎng)基配比不均衡。而老葉也是如此。綜合考慮，中葉培養(yǎng)基是灰樹花固體發(fā)酵的最適培養(yǎng)基。

2.2 不同輔料對灰樹花固體發(fā)酵基質(zhì)的影響

不同輔料其含碳量、含氮量各不相同，在培養(yǎng)基中加不同輔料，可優(yōu)化其碳氮比，有利于食用菌的生長。從表2中可以看出，添加大豆輔料，其多糖、三萜含量顯著高于其他輔料，生長速度也是如此，而茶多酚、氨基酸和酚氨比無顯著性差異，可能是由于添加大豆而調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的碳氮比，更適宜灰樹花的生長和代謝產(chǎn)物多糖的積累。綜合考慮，選擇大豆為灰樹花固體發(fā)酵的最佳輔料。

2.3 灰樹花固體發(fā)酵茶青過程的內(nèi)含物質(zhì)的變化

對灰樹花固體發(fā)酵茶青的過程進行了研究，結(jié)果如圖1、圖2所示，前3d多糖含量呈現(xiàn)降低趨勢，第3d多糖降到最低，3～9d多糖的合成處于快速增長期，9d之后增長趨勢減緩，直至18d以后多糖的合成才基本穩(wěn)定并達到最高值 5.14%，多糖增長了44.38%，前3d灰樹花處于生長期，利用了茶葉中的一部分多糖，之后灰樹花代謝合成多糖并積累;而三萜含量在0～9d之間呈明顯的下降趨勢，9～15d又有緩慢的上升趨勢，到15d三萜增長了5.55%，15d之后三萜含量開始下降，這可能是底物已經(jīng)耗盡，灰樹花利用了三萜，并可能轉(zhuǎn)化為其他有效活性成分;酚氨比6～9d急劇下降，前6d下降趨勢較緩和，9d后基本穩(wěn)定，第12d酚氨比達到最小值 1.56，降低了79.6%左右，12d以后稍微有上升的趨勢，但變化不大;茶多酚的變化趨勢與酚氨比相一致，一直處于降低的趨勢，降低了77.8%左右;氨基酸自始至終變化較小，第9d達到最低0.77%，降低了26.7%，后期緩慢上升。茶多酚和氨基酸的降低可能是由于6～9d是灰樹花的對數(shù)生長期，代謝活性最強，底物利用率最高。其五個指標(biāo)在第9d都趨于穩(wěn)定，并達到最佳狀態(tài)，因此灰樹花固體發(fā)酵茶青的最佳發(fā)酵時間為9d。

表3 發(fā)酵前后菌質(zhì)主要呈味物質(zhì)的變化Table 3 Changes of the main components of savor of fungal substance in before and after fermentation

圖1 灰樹花固體發(fā)酵菌質(zhì)多糖和三萜的動態(tài)變化圖Fig.1 Dynamic change of the polysaccharide and the triterpene of fungal substance in solid－state fermentation of Grifola frondosa

圖2 灰樹花固體發(fā)酵菌質(zhì)品質(zhì)的動態(tài)變化圖Fig.2 Dynamic change of the quality of fungal substance in solid－state fermentation of Grifola frondosa

以灰樹花固體發(fā)酵的第9d為發(fā)酵終點，比較發(fā)酵前后菌質(zhì)呈味物質(zhì)的變化。如表3所示，發(fā)酵后茶多酚從8%降低為1.78%，降低了77.8%，游離氨基酸從最初的1.05%降低為0.77%，降低了26.7%，酚氨比則降低了69.9%，這三者的變化呈顯著性差異，而多糖從起初的3.56%增加到4.69%，增加了31.7%，但無顯著性差異。

3 結(jié)論與討論

在本研究的前期實驗中，我們選用了靈芝的美國靈芝、泰山靈芝、甜芝、鹿角靈芝、京大、韓國靈芝，灰樹花的灰樹花1號、灰樹花2號、灰樹花，猴頭菇的常山猴頭、常山99、猴頭王、猴頭BJ－5、大猴頭、猴頭T3、猴頭菇、猴頭六號共17個菌株在茶葉培養(yǎng)基上進行了馴化及培養(yǎng)實驗，結(jié)果表明灰樹花GF2號菌株的生長速度最快，產(chǎn)多糖量最多，因此選擇該菌株作為本次實驗的菌株。

通過實驗發(fā)現(xiàn)茶青的老嫩程度對灰樹花的生長速度、多糖的形成及發(fā)酵后基質(zhì)風(fēng)味的變化影響較大，選擇中葉為最佳培養(yǎng)基。林戎斌等人［14］研究發(fā)現(xiàn)靈芝發(fā)酵茶最適茶培養(yǎng)基為茶青，并未研究茶青的老嫩度。陳濟琛等人［15］將低檔茶葉作為發(fā)酵培養(yǎng)基，使其被靈芝發(fā)酵，產(chǎn)生的菌質(zhì)提取液對提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能和血清溶血素水平有顯著的效果。

輔料的種類顯著影響灰樹花的生長速度、多糖和三萜的含量，而茶多酚、氨基酸和酚氨比無顯著性差異。輔料的添加優(yōu)化了培養(yǎng)基的碳氮比，利于灰樹花的生長和活性物質(zhì)的形成，而對培養(yǎng)基原內(nèi)含物的影響無顯著性差異。

茶葉滋味主要是由茶多酚(苦澀味)、氨基酸(鮮爽味)、水溶性糖(回甘味)等物質(zhì)組成，酚氨比是茶葉主要呈味物質(zhì)含量協(xié)調(diào)的綜合反映，比值的高低反映了茶葉的滋味，比值越高，苦澀味越濃，滋味越差，酚氨比值越低，則越醇和，滋味越好［13］，本研究的酚氨比顯著降低了69.9%;據(jù)報道水溶性多糖含量越高，茶的回甘性越好，茶葉品質(zhì)越佳［16］。本研究的發(fā)酵茶水溶性多糖含量為4.69%，比林新堅等［17］研制的靈芝發(fā)酵茶中的水溶性多糖為1.2%有明顯提高。因此，灰樹花固體發(fā)酵茶青后，其菌質(zhì)的風(fēng)味和保健功效有很大提高，對粗老鮮葉的開發(fā)與利用有重要的指導(dǎo)意義。

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Study on solid－state fermentation of Grifola frondosa with tea green as the substrate

MA Li－qing1，GUO Li－qiong1，2，LIN Jun－fang1，2，*，ZOU Yu－lin1
(1.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510640，China; 2.Institute of Biomass Research South China Agricultural University，Guangzhou 510640，China)

Contents changes of various components and quality of the tea green in fermentation of Grifola frondosa was studied.The optimum medium components and culture conditions were determined as follows:Medium tea green，soybean powder 2%，inoculation amount 1%，temperature 25℃and fermentation time 9d.After fermentation，the effective components of fungal substance were studied as follows:Tea polyphenols 1.78%，free amino acid 0.77%，polyphenols/amino acid value 2.3，polysaccharide 4.69%.Compared with the raw fungal substance，polysaccharides was increased by 31.7%，tea polyphenols were decreased by 77.8%，free amino acids were decreased by 26.7%and the proportion of polyphenol and amino acid was decreased by 69.9%，which revealed that the tea quality was improved greatly.

polysaccharide;tea polyphenols;amino acid;tea green

TS201.3

A

1002－0306(2012)10－0228－04

灰樹花(Grifola frondosa)又名貝葉多孔菌、千佛菌、栗子蘑、云蕈、蓮花菌等，日本稱之舞茸。其子實體中富含氨基酸、多糖以及微量元素等，其中灰樹花多糖是主要的生物活性成分［1］。大量的藥理藥效的研究證明，灰樹花多糖具有顯著的抗腫瘤［2］、降血糖、抗肝炎［3－4］、抗HIV病毒［5－6］以及改善免疫系統(tǒng)［7－8］等功效。茶葉營養(yǎng)成分豐富，富含多種蛋白質(zhì)、氨基酸、生物堿、咖啡因、茶多酚、茶多糖、茶色素和多種維生素及礦物質(zhì)，具有較好的保健功效。隨著茶葉生產(chǎn)和茶葉市場的快速發(fā)展，在茶葉種植和生產(chǎn)過程中，數(shù)量龐大的茶場修整枝葉和茶廠廢碎茶末，拋之可惜甚至污染環(huán)境，用之無法或者效率低、價值差。我國產(chǎn)茶大省云南、福建、浙江等尤為突出。僅就云南省的調(diào)查結(jié)果，現(xiàn)有茶葉種植面積280萬畝，年產(chǎn)茶葉10萬余t，每年自修整、采摘、加工過程中，約有30%即3萬余t成為廢枝葉、茶末被遺棄。對于價值較低的粗老茶鮮葉(粗老葉、秋冬修剪葉、廢碎茶)進行精細加工，實現(xiàn)低檔原料的深度開發(fā)和綜合利用，變廢為寶，對提高茶葉生產(chǎn)的經(jīng)濟效益是十分必要的。此研究是用灰樹花直接作用于以粗老茶葉、秋冬修剪葉為主要原料的固體培養(yǎng)基，并對其進行固體發(fā)酵以達到改善茶品質(zhì)的目的。

2011－01－10 *通訊聯(lián)系人

馬立青(1983－)，女，碩士研究生，研究方向:微生物資源開發(fā)與利用。

國家自然科學(xué)基金項目(31071837);廣東省科技計劃(2009B020201012)。