薛曉麗，王忠合，于淑娟

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

果糖基甘氨酸的合成及其與銅(Ⅱ)、鎳(Ⅱ)配位特性的研究

薛曉麗，王忠合，于淑娟*

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

合成并純化了Maillard反應初級階段產(chǎn)物——果糖基甘氨酸(DFG)，并且利用離子色譜、質(zhì)譜、核磁共振等方法分析其純度及結構。結果表明:合成產(chǎn)物為目標化合物，且分子式為C8H15NO7，相對分子質(zhì)量237。采用pH電位滴定法測定了溫度(303±0.1)K，離子強度I=0.1mol/L的NaCl溶液中DFG與銅(Ⅱ)、鎳(Ⅱ)配合物穩(wěn)定常數(shù)，DFG合銅配合物穩(wěn)定常數(shù)對數(shù)值分別為lgK1=7.24±0.09，lgK2=6.57±0.05，lgK3=3.31±0.02;DFG合鎳配合物穩(wěn)定常數(shù)對數(shù)值分別為lgK1=5.73±0.03，lgK2=4.69±0.02，lgK3=3.59±0.05，且DFG合銅配合物穩(wěn)定性大于DFG合鎳配合物的穩(wěn)定性。

Maillard反應，果糖基甘氨酸，配位特性，銅(Ⅱ)，鎳(Ⅱ)

果糖基氨基酸是美拉德反應(還原糖與氨基化合物發(fā)生的非酶褐變)初級階段形成的一類關鍵的中間產(chǎn)物，是由N－取代葡萄糖胺經(jīng)Amadori重排而來，被稱為Amadori重排產(chǎn)物(ARPs)［1］，又稱為N－取代－1－脫氧－D－果糖基氨基酸，反應路徑見圖1。果糖基氨基酸是白色固體，常溫下化學性質(zhì)相對較穩(wěn)定，沒有氣味;但是經(jīng)過加熱后產(chǎn)生具有芳香氣味的化合物，如吡嗪類、呋喃類以及吡喃類化合物等［2－3］。該類化合物是重要的非揮發(fā)性香味前體物質(zhì)，在煙草加工中添加這類物質(zhì)可以增加煙草的甜香和烘烤香，改善吸味［4］。此外，在食品的加工與儲藏過程中也會產(chǎn)生這類物質(zhì)，尤其是在干制的果蔬中，可達每干重水可溶物含量的10%以上［2，5－6］。與其它糖胺類物質(zhì)類似，果糖基氨基酸對 Mg2+，Cu2+，Pt2+，Ni2+等金屬離子也具有一定的絡合能力［5－7］。從結構上分析，它可看作是相應氨基酸的衍生物，作為二齒配體以α－碳上的氨基和羧基作為配位基團同金屬離子配位。同時，果糖基氨基酸具有人體內(nèi)源性結構特征，既有半縮醛結構，又引入L－構型氨基酸，對人體毒害性小［8］。因此，這類物質(zhì)也可作為一種重金屬離子捕集劑應用于醫(yī)藥領域。本文采用葡萄糖和甘氨酸作為原料，直接加熱回流合成果糖基甘基酸，用陽離子交換樹脂分離純化，產(chǎn)物采用光譜與波普法進行結構表征，最后采用pH電位滴定法測定該化合物與銅(Ⅱ)、鎳(Ⅱ)配合物的穩(wěn)定常數(shù)，為研究果糖基甘基酸(DFG)的金屬配位特性及其應用提供一定的理論依據(jù)。

圖1 果糖基氨基酸反應生成式Fig.1 Mechanism of formation of fructose－amino acids

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Amberlite IRN－77氫型離子交換樹脂 美國Fluke公司;無水葡萄糖、甘氨酸、焦亞硫酸鈉、鐵氰化鉀、無水甲醇、無水乙醇、氨水、氫氧化鈉、氯化鈉、硝酸銅等 均為國產(chǎn)分析純。

DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南鞏義予華儀器有限責任公司;RE－2000旋轉蒸發(fā)儀，SHZ－Ⅲ循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;硅膠G薄層層析板 青島海洋化工廠;Dionex ICS－5000型離子色譜儀 美國Dionex公司;Esquire HCT PLUS色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀、BrukerAVANCE－400型核磁共振儀(采用 D2O為溶劑) 德國 Bruker公司; Titrando888型智能電位滴定儀 瑞士萬通。

1.2 實驗方法

1.2.1 果糖基甘氨酸的合成 葡萄糖和甘氨酸摩爾比4∶1，加入一定量的焦亞硫酸鈉作為催化劑，溶于80mL 1∶1甲醇－水溶液中，混合物于室溫下攪拌20min，回流加熱8h，反應結束后體系呈棕黃色糖漿狀，冷卻后加入到250mL 1∶1乙醇－水體系中，用陽離子交換柱(2.5×45cm，H+)分離純化，分別用750mL 1∶1乙醇－水、250mL水和2.5L 0.1mol/L氨水洗脫。用茚三酮法和普魯士藍法對洗出液進行檢驗［9－10］。收集洗脫液，減壓濃縮，向濃縮液中加入3倍體積的甲醇(超聲)，4℃放置過夜，析出白色晶體，重結晶，干燥，稱重，產(chǎn)率約為14.6%(以甘氨酸重計)。

1.2.2 薄層色譜(TLC)法檢測 溶解少量甘氨酸和樣品，點樣于硅膠板上，以正丁醇－冰醋酸－水(4∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.2%的茚三酮丙酮溶液，120℃加熱2～5min，日光檢視。

1.2.3 離子色譜－積分安培法(HPAEC－PAD)檢測 稱取一定量的樣品配制成濃度為5mg/L的溶液，過0.22μm濾膜，采用離子色譜－積分安培法檢測果糖基甘氨酸的含量。檢測條件為:CarboPac PA1糖分析柱(i.d.4×250mm)，積分安培電化學檢測器，淋洗速度1mL/min，洗脫劑為NaOAc(300mmol/L)、超純水和NaOH(300mmol/L)，淋洗梯度見表1。

1.2.4 質(zhì)譜及13C核磁共振分析 選用電噴霧離子源質(zhì)譜(ESI－MS)進行分析，電噴霧離子源(ESI);電離模式:正離子模式;質(zhì)量掃描范圍，m/z50～800amu;毛細管電壓:－103.0V。以氘代水(D2O)為溶劑，將分離純化得到的產(chǎn)物作碳譜分析。

1.2.5 電位滴定法測定質(zhì)子化常數(shù) 在50.00mL滴定體系中，DFG濃度為1.0×10－2mol/L，實驗條件為(303±0.1)K，用0.2mol/L NaCl溶液調(diào)整體系的離子強度I為0.1mol/L，實驗溶液均用重蒸水配制，在氮氣保護下，選擇動態(tài)滴定模式，用已除去CO2的氫氧化鈉標準溶液(0.1038mol/L)滴定，平行滴定兩次，記錄NaOH溶液消耗量和溶液pH的變化，采用Bjerrum［11］提出的半整數(shù)法求得DFG的累積質(zhì)子化常數(shù)，計算公式歸納如下［11－13］:

表1 洗脫液淋洗梯度Table 1 Gradient program for N－(1－deoxy－D－fructos－1－yl)－glycine

1.2.6 DFG與Cu2+、Ni2+配合物穩(wěn)定常數(shù)的測定在50.00mL滴定體系中，金屬離子濃度為1.0×10－3mol/L，DFG濃度為5.0×10－3mol/L，實驗條件為(303 ±0.1)K，用0.2mol/L NaCl溶液維持溶液的離子強度為0.1mol/L，其余步驟同1.2.5，求得DFG與金屬離子所生成的配合物的穩(wěn)定常數(shù)對數(shù)值lgK，絡合物穩(wěn)定常數(shù)的計算公式歸納如下:

式中，CM為金屬離子的總濃度，mol/L;［L－］為體系中游離配位體DFG的濃度，mol/L;其余符號的意義同1.2.5。

以［L－］的負對數(shù)p［L－］對做生成函數(shù)曲線圖，為半整數(shù)點對應的p［L－］值即為所求絡合穩(wěn)定常數(shù)的對數(shù)值lgK。

2 結果與討論

2.1 TLC檢測

葡萄糖與甘氨酸溶液加熱反應后為橙褐色，經(jīng)陽離子交換樹脂分離后得到的結晶為白色，薄層色譜檢測比移值 Rf為0.14，甘氨酸的比移值 Rf為0.24，與文獻報道的數(shù)據(jù)一致［5］。因此，采用薄層色譜法可區(qū)分產(chǎn)物與合成原料甘氨酸的差異。

2.2 離子色譜－積分安培(HPAEC－PAD)檢測結果

目前，果糖基氨基酸的測定方法主要有高效液相色譜－示差折光檢測(HPLC－RD)和紫外檢測(HPLC－UV)分析法、離子色譜－積分安培檢測法(HPAEC－PAD)等。液相色譜法檢測糖類化合物存在一些問題，例如糖類化合物的紫外吸收很弱，需要采用示差折光檢測器，但其靈敏度較低。離子色譜法測定糖類物質(zhì)，不僅前處理簡單，而且采用高靈敏度和高選擇性的脈沖安培檢測器，準確度高，重現(xiàn)性好［14－15］。因此，離子色譜法可用以區(qū)分產(chǎn)物與合成原料中的葡萄糖。陽離子樹脂分離前后產(chǎn)物的離子色譜圖，如圖2和圖3所示，通過與葡萄糖標準品對比以及相關文獻［16－17］的報道，圖2中15min峰即1號峰為葡萄糖，在35min洗脫液梯度變化后出現(xiàn)的峰為果糖基甘氨酸產(chǎn)物峰。所以直接加熱反應后的粗產(chǎn)物經(jīng)陽離子交換柱分離后，分離效果顯著，產(chǎn)物純度得到大幅度提升。

圖2 柱分離前離子色譜圖Fig.2 Chromatogram before column separation

圖3 柱分離后離子色譜圖Fig.3 Chromatogram after column separation

2.3 質(zhì)譜(EMI－MS)及13C核磁共振分析

對結晶產(chǎn)物進行一級電噴霧離子源質(zhì)譜分析，從分子量上即可確定產(chǎn)物為目標產(chǎn)物。從圖4可以看出其分子離子峰［M+H］+為237.5，可以判斷相對分子質(zhì)量為236.5(237)，與DFG理論相對分子質(zhì)量相符，相對分子質(zhì)量為奇數(shù)，根據(jù)氮規(guī)律，分子中含有奇數(shù)個氮原子，DFG的分子式為C8H15NO7。由于產(chǎn)物中含有果糖基，在水溶液中有四種異構體及開環(huán)式，使其碳譜較為復雜，結果見表2。

2.4 DFG與Cu2+、Ni2+配合物的穩(wěn)定常數(shù)

pH電位滴定法測定配合物穩(wěn)定常數(shù)的原理是:當配體為弱酸或弱堿時，配合物的形成會改變?nèi)芤旱膒H，凡金屬離子與配體形成配合物的反應中，伴隨有質(zhì)子釋放的體系，均可用pH法進行研究，且該測定方法精確，較為常用。滴定曲線如圖5所示，分別對比圖中DFG的滴定曲線與有金屬離子存在的DFG滴定曲線中相同pH下消耗NaOH溶液的體積，可以看出DFG與Cu2+和Ni2+均可發(fā)生配位反應。

圖4 DFG一級電離質(zhì)譜圖(1.3min)Fig.4 The positive ion ESI－MS spectrometry of DFG(1.3min)

表2 DFG碳譜化學位移Table 2 13C－N.M.R chemical shifts

溶液中Cu2+、Ni2+能形成配位數(shù)為4或6的配合物，DFG與甘氨酸類似，作為二齒配體可通過氧原子和氮原子與金屬離子配位而形成配合物，故限制了金屬離子最多只能與2個或3個DFG配位。經(jīng)計算DFG與Cu2+配合物穩(wěn)定常數(shù)的對數(shù)值分別為lgK1= 7.24±0.09，lgK2=6.57±0.05，lgK3=3.31±0.02，DFG與Ni2+配合物穩(wěn)定常數(shù)的對數(shù)值分別為lgK1=5.73 ±0.03，lgK2=4.69±0.02，lgK3=3.59±0.05。由以上數(shù)據(jù)可知，DFG對Cu2+的配位能力比對Ni2+的配位能力強，形成相應配合物DFG合銅的穩(wěn)定性也比DFG合鎳的穩(wěn)定性高。

3 結論

以葡萄糖和甘氨酸為原料合成Maillard反應的初級階段反應產(chǎn)物——果糖基甘氨酸(DFG)，并用陽離子交換樹脂分離純化，利用離子色譜、質(zhì)譜、核磁共振等方法分析其結構及純度，證明所得產(chǎn)物為目標化合物，并得出如下結果:外觀為白色晶體，無味，極易溶于水，分子式為C8H15NO7，相對分子質(zhì)量237。該方法操作簡便，使用原料及試劑價格低廉，而且可得到純度較好的產(chǎn)品。pH電位滴定法測得DFG對Cu2+的配位能力大于對Ni2+的配位能力，且DFG合銅配合物穩(wěn)定性大于DFG合鎳配合物穩(wěn)定性，為針對螯合劑篩選金屬離子，拓寬果糖基甘氨酸的應用領域提供了一定的理論依據(jù)。

圖5 滴定曲線Fig.5 pH－Titration curves

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Synthesis of N－(1－deoxy－D－fructos－1－yl)－glycine(DFG) and its coordination properties to Cu(Ⅱ)，Ni(Ⅱ)

XUE Xiao－li，WANG Zhong－h(huán)e，YU Shu－juan*(College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

N－(1－deoxy－D－fructos－1－yl)－glycine(DFG)was synthesized and purified，which was believed to be the key intermediate in the early stages of the model for the glucose/glycine Maillard reaction.Thin layer chromatography，ion chromatography，mass spectrometry and13C nuclear magnetic resonance were used to analyze and verify the desired product.The results indicated that C8H15NO7was DFG’s molecular formula with relative molecular mass of 237.DFG’s protonation constants and metal－complex stability constants with Cu2+，Ni2+ions were determined by pH potentiometric titration under(303±0.1)K in ionic strength I=0.1mol/L NaCl solution. Stability constants of DFG complexed with Cu2+were lgK1=7.24±0.09，lgK2=6.57±0.05，lgK3=3.31±0.02，respectively，which were higher than stability constants of DFG complexed with Ni2+(lgK1=5.73±0.03，lgK2=4.69 ±0.02，lgK3=3.59±0.05).

Maillard reaction;N－(1－deoxy－D－fructos－1－yl)－glycine(DFG);coordination properties;Cu(Ⅱ);Ni (Ⅱ)

TS201.2

A

1002－0306(2012)08－0121－04

2011－06－30 *通訊聯(lián)系人

薛曉麗(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:食品化學。

廣東省自然科學基金(10251064101000014);華南理工大學基本科研業(yè)務費(2011ZP009);粵港關鍵領域重點突破項目(2009A020700007)。