王強(qiáng)，郎軼詠，任常順，朱曉紅，于曉黎

(解放軍第202醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110003)

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郎軼詠，E-mail：langyiyong0452@126.com

藍(lán)萼香茶菜不同部位藍(lán)萼甲素的含量測(cè)定及采收期考察

王強(qiáng)，郎軼詠*，任常順，朱曉紅，于曉黎

(解放軍第202醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110003)

目的考察藍(lán)萼香茶菜不同部位藍(lán)萼甲素的含量及最適采收期。方法采用反相高效液相色譜法，色譜柱為島津C18ODS，流動(dòng)相為甲醇-水(60∶40)，流速為0.9 mL·min-1，柱溫為25 ℃，于波長(zhǎng)234 nm條件下對(duì)樣品中藍(lán)萼甲素的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果以葉中藍(lán)萼甲素含量最高，且7、8月份采集的葉中藍(lán)萼甲素含量較高。結(jié)論藍(lán)萼香茶菜應(yīng)在夏季采收，并以葉入藥為宜。

藍(lán)萼香茶菜；藍(lán)萼甲素；高效液相色譜法

唇形科香茶菜屬植物在我國(guó)資源豐富，藍(lán)萼香茶菜Rabdosiajaponica(Burm.f.)Hara var.glaucocalyx(Maxim.)Hara有較好的心血管作用，系我國(guó)首先發(fā)現(xiàn)[1-3]，從該植物中分離得到的二萜單體藍(lán)萼甲素glycocalyxin A具有顯著的增加小鼠心肌營(yíng)養(yǎng)性血流量作用和抗血小板凝集作用。藍(lán)萼甲素是該植物的有效成分之一[4-5]。為了了解該成分在植物體內(nèi)的分布及不同生長(zhǎng)期的消長(zhǎng)情況，確定正確的采摘期及最佳入藥部位，以便更好地利用植物資源，我們研究建立了藍(lán)萼香茶菜中藍(lán)萼甲素含量測(cè)定方法，考察藍(lán)萼香茶菜不同部位及不同采收時(shí)間的藍(lán)萼甲素含量。

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀LC-20AT(日本島津)。藍(lán)萼甲素對(duì)照品(解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)天然藥化教研室提供，高效液相色譜歸一化法測(cè)定純度為99.3%)，藍(lán)萼香茶菜根、莖、葉分別于2010年7～9月采自遼寧千山、沈陽(yáng)、丹東、本溪、撫順，采樣信息見表1。經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院鄭漢臣教授鑒定為藍(lán)萼香茶菜Rabdosiajaponica(Burm.f.)Hara var.glaucocalyx(Maxim.)Hara的根、莖、葉。流動(dòng)相為色譜用甲醇，其余試劑均為分析純。

表1 藍(lán)萼香茶菜樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為島津C18ODS；柱溫為25 ℃；流動(dòng)相為甲醇-水(60∶40)；流速為0.9 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為234 nm；進(jìn)樣量為20 μL。理論板數(shù)按藍(lán)萼甲素峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，與相鄰峰的分離度不小于1.5。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取100 mg藍(lán)萼甲素對(duì)照品，置100 mL容量瓶中加適量甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。HPLC圖見圖1。

2.3 樣品溶液的制備

分別精密稱取樣品粗粉10 g，以乙醚150 mL提取，以甲醇5 mL溶解殘留物，濾液加入150 mg活性炭脫色，過(guò)濾，溶液揮干，干法上硅膠柱(8.0 cm×150 cm，200～300目，5 g)，分別以三氯甲烷-丙酮(15∶1，7∶1)100 mL洗脫，以TLC[硅膠G板，三氯甲烷-丙酮(10∶1)展開，硫酸-甲醇為顯色劑，藍(lán)萼甲素為對(duì)照]檢查，收集含藍(lán)萼甲素各段，水浴蒸干，以甲醇10 mL溶解，微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾，移至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，備用。HPLC圖見圖2。

圖1 藍(lán)萼甲素對(duì)照品的HPLC圖

圖2 藍(lán)萼香茶菜提取物HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取以上藍(lán)萼甲素貯備液0.1，0.2，0.4，0.5，0.6 mL置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣20 μL，以峰面積與對(duì)應(yīng)濃度(μg·mL-1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=11 301X+33 708，r=0.996 4。結(jié)果表明藍(lán)萼甲素濃度在4～24 μg·mL-1與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取濃度為12 μg·mL-1的藍(lán)萼甲素對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積的RSD=0.43%。結(jié)果表明精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取藍(lán)萼香茶菜葉(千山樣品，7月份采集)，按2.3項(xiàng)下方法制備，分別于制備后0，1，3，5，7 h依法測(cè)定，結(jié)果峰面積的RSD=1.47%。

2.5.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取藍(lán)萼香茶菜葉(千山樣品，7月份采集)5份，分別按2.3項(xiàng)下方法制備，測(cè)定其藍(lán)萼甲素的峰面積，計(jì)算RSD=2.09%。

2.5.4 回收率試驗(yàn) 取已知含量的藍(lán)萼香茶菜葉(千山樣品，7月份采集)150 mg，精密加入藍(lán)萼甲素對(duì)照品(1.25 mg·mL-1)溶液1 mL，按2.3項(xiàng)下方法制成供試液，每次進(jìn)樣20 μL，測(cè)定藍(lán)萼甲素的含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.6 樣品測(cè)定結(jié)果

取樣品溶液，每批樣品5份，用甲醇適當(dāng)稀釋后取20 μL注入液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果見表3、4。

表2 藍(lán)萼香茶菜中藍(lán)萼甲素加樣回收率試驗(yàn)

注：藍(lán)萼甲素對(duì)照品加入量均為1.250 mg

表3 不同地區(qū)7月采摘的藍(lán)萼香茶菜根、莖、葉中藍(lán)萼甲素的含量(n=5) /%

表4 不同地區(qū)不同采摘時(shí)間藍(lán)萼香茶菜葉中藍(lán)萼甲素的含量(n=5) /%

3 討論

將同一批藍(lán)萼香茶菜均勻樣品粉末分別用水、乙醇和乙醚提取，結(jié)果表明，乙醚提取的效率最佳，水的提取效率最差。因此采用乙醚回流提取，將提取物用甲醇溶解后上硅膠柱可對(duì)提取物中藍(lán)萼甲素進(jìn)行富集，去除不必要雜質(zhì)，提高含量測(cè)定的準(zhǔn)確度。

經(jīng)測(cè)定分析發(fā)現(xiàn)，不同部位中藍(lán)萼甲素的含量以葉中最高；不同采集期以7、8月份含量較高，9月末含量下降，這可能和植物的生長(zhǎng)周期有關(guān)，撫順、千山的藍(lán)萼香茶菜中藍(lán)萼甲素含量較高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藍(lán)萼香茶菜應(yīng)在夏季采收，并以葉入藥為宜。

[1] 任常順，葉麗卡.香茶菜屬植物研究進(jìn)展[J].遼寧藥物與臨床，2002，5(2)：91.

[2] 桂明玉，金永日，劉松艷，等.藍(lán)萼香茶菜化學(xué)成分研究Ⅱ[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2000，35(6)：374-375.

[3] 金永日，桂明玉，王寶珍.藍(lán)萼香茶菜根化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志，2000，25(11)：678-679.

[4] 楊秀偉，趙靜.藍(lán)萼香茶菜化學(xué)成分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，15(6)：490-493.

[5] 項(xiàng)昭保，徐一新，陳海生，等.藍(lán)萼香茶菜化學(xué)成分研究[J].中成藥，2009，31(5)：763-764.

DetectContentsofGlaucocalyxinAinRabdosiajaponicavar.GlaucocalyxDifferentPartatDifferentCollectedTime

WANG Qiang,LANG Yi-yong, REN Chang-shun,YU Xiao-li

(No202thhospitalofPLA,Shenyang110003,China)

Objective:To study content of glaucocalyxin A in different part ofRabdosiajaponicavar.Glaucocalyxat different collected time and select the perfect time.MethodsHPLC was used to detect the content of glaucocalyxin A. HPLC separation was performed on Symmetry C18column with a solvent system of methanol-water(60∶40). The detection wavelength was 234 nm. The flow rate was 1 mL·min-1. The column temperature was 25 ℃.ResultsThe content was the highest in leaves of Rabdosia japonica var which was collected in July and August.ConclusionRabdosiajaponicavar.Glaucocalyx’s leaves should be collected at summer.

Rabdosiajaponicavar.Glaucocalyx; Glaucocalyxin A; HPLC

2011-12-09)