劉偉，劉建華，周潔，王曉*，耿巖玲，李奉勝

(1.山東省科學(xué)院中藥過程控制研究中心/山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014；2.萊蕪紫光生態(tài)園有限公司，山東 萊蕪 271100)

國家自然科學(xué)基金(81102749)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2011GSF11908，2012GGA12024)；山東省科學(xué)院科技發(fā)展計(jì)劃(科基合字(2011)第3號)

*

王曉，Tel：(0531)82605304，E-mail：wangxiao2008@yahoo.cn

不同生長年限對丹參活性成分含量的影響△

劉偉1，劉建華1，周潔1，王曉1*，耿巖玲1，李奉勝2

(1.山東省科學(xué)院中藥過程控制研究中心/山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014；2.萊蕪紫光生態(tài)園有限公司，山東 萊蕪 271100)

目的研究不同生長年限對山東白花丹參及紫花丹參活性成分含量的影響。方法采用HPLC法測定不同生長年限白花及紫花丹參中脂溶性成分(二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參新酮)和水溶性成分(丹酚酸B、迷迭香酸)含量。結(jié)果1年生白花丹參5種脂溶性成分總含量為6.18 mg·g-1，2年生總含量為 3.63 mg·g-1，而1年生紫花丹參5種脂溶性成分總含量為7.08 mg·g-1，2年生總含量為7.06 mg·g-1；1～2年生白花丹參中水溶性成分總量分別為44.44 mg·g-1和43.19 mg·g-1，紫花丹參分別為38.89 mg·g-1和49.12 mg·g-1。結(jié)論比較丹參活性成分總含量，白花丹參以1年生質(zhì)量為佳，紫花以2年生綜合品質(zhì)為佳；相同砂質(zhì)土壤栽培條件下的紫花丹參質(zhì)量高于相同年限的白花丹參。

丹參；生長年限；脂溶性成分；水溶性成分

中藥丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，其有效成分為脂溶性的菲醌類衍生物和水溶性的酚酸類成分。前者具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等作用，而后者主要作用為抗氧化、抗肝損傷、保護(hù)心肌等[1]。根據(jù)開花顏色丹參分為紫花和白花兩類，一般常用中藥丹參為紫花丹參，而白花丹參SalviamiltiorrhizaBge. F. alba.為其變型，其花顏色為白色，區(qū)別于普通丹參的紫紅色，野生白花丹參主要分布在山東泰沂山脈，為山東道地藥材[2]。研究表明，白花丹參丹參酮ⅡA、丹酚素含量較高[3]，其藥理作用對血栓閉塞性脈管炎有獨(dú)特療效[4]。丹參中成分除丹參酮和丹酚酸B外，還含有像隱丹參酮、丹參新酮、二氫丹參酮、迷迭香酸等物質(zhì)[5]，且其含量均較高。

本研究以1年生及2年生白花丹參、紫花丹參為研究對象，對丹參中脂溶性、水溶性多個成分進(jìn)行同時測定，研究不同生長年限對白花丹參及紫花丹參活性成分的影響，明確不同丹參及生長年限對其質(zhì)量的影響，對丹參質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀；Agilent DAD檢測器；Agilent Chemstation工作站。

1.2 材料

1.2.1 藥材 丹參樣品，白花丹參及紫花丹參采集于山東萊蕪苗山鎮(zhèn)萊蕪紫光生態(tài)園丹參種植基地，基地土壤背景一致，樣品采集時間為2011年11月2日，分別選擇長勢一致的丹參樣品4株作為每個處理的重復(fù)樣品。采集的樣品在同一條件下陰干，磨碎，裝入封口袋中密封冷藏。原植物經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳副教授鑒定為白花丹參及紫花丹參。

1.2.2 對照品 二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參新酮、丹酚酸B(天然產(chǎn)物國家標(biāo)準(zhǔn)樣品參比實(shí)驗(yàn)室制備，純度≥98%)、迷迭香酸(批號：MUST-12020702，純度≥98%，購自成都曼思特生物科技有限公司)。

1.2.3 試劑 甲醇(色譜純)，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 方法

1.3.1 脂溶性成分測定方法 提取方法：按照田宇紅的方法[6]，取丹參粉末1.000 g，置磨口錐形瓶中，加入甲醇50 mL，精密稱定重量，加熱回流1 h，放冷后稱重，用甲醇補(bǔ)足減損的重量，搖勻后過濾，過0.45 μm濾膜，HPLC測定。見圖1。

色譜條件：Inertsil-1色譜柱C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，脂溶性成分測定條件：流動相為乙腈-0.2%醋酸(55∶45)，檢測波長為270 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫20 ℃，進(jìn)樣體積20 μL。

1.3.2 水溶性成分測定方法 提取方法：按照文獻(xiàn)方法[7]，取丹參粉末1.000 g，置磨口錐形瓶中，加入60%甲醇50 mL，超聲30 min，過0.45 μm濾膜，HPLC測定。見圖2。

色譜條件：梯度洗脫，流動相初始比例為0.2%醋酸-乙腈(95∶5)，測定時間為40 min，30 min時流動相變?yōu)?.2%醋酸-乙腈(65∶35)，30～36 min流動相為100%乙腈，37～43 min變?yōu)槌跏剂鲃酉?；檢測波長為280 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫20 ℃，進(jìn)樣體積20 μL。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密稱取經(jīng)減壓干燥24 h后的二氫丹參酮0.5 mg，隱丹參酮3.0 mg，丹參酮Ⅰ3.9 mg，丹參酮ⅡA3.3 mg，溶于甲醇后定容至10 mL，稀釋5倍作為混合對照品溶液。稱取丹參新酮5.2 mg溶于甲醇定容至10 mL，稀釋10倍作為對照品溶液；稱取丹酚酸B 3.2 mg，迷迭香酸3.7 mg分別溶于甲醇后定容至10 mL，作為水溶性成分測定對照品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

取上述混合對照品溶液及丹參新酮對照品溶液，分別進(jìn)樣0、5、10、15、20 μL(丹參新酮進(jìn)樣0、1、2、3、4 μL)，按方法中條件測定峰面積。以進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)樣品量為橫坐標(biāo)(X)，千分之一峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 丹參活性成分標(biāo)準(zhǔn)曲線

A.脂溶性成分對照品 B.丹參新酮對照品 C.丹參樣品1.二氫丹參酮 2.隱丹參酮 3.丹參酮Ⅰ 4.丹參酮ⅡA 5.丹參新酮圖1 丹參脂溶性成分HPLC圖譜

A.迷迭香酸對照品 B.丹酚酸B對照品 C.丹參樣品1.迷迭香酸 2.丹酚酸B圖2 丹參水溶性成分HPLC圖譜

2.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參新酮、丹酚酸B、迷迭香酸7種成分的峰面積，平均峰面積分別為11 185×103、62 409×103、13 247×103、98 356×103、4 467×103、19 4127×103、15 535×103。RSD分別為0.5%、0.8%、6.3%、0.7%、1.7%、0.3%、0.8%。

2.3 穩(wěn)定性考察

取同一批丹參樣品5份，按方法中色譜條件進(jìn)行測定，測定時間分別為0，2，4，6，8 h，結(jié)果二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參新酮、丹酚酸B、迷迭香酸峰面積平均值分別為10 590×103、61 450×103、12 602×103、95 653×103、4 328×103、203 861×103、15 728×103。RSD分別為3.3%、5.2%、3.9%、3.1%、3.3%、3.7%、1.0%，表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批丹參樣品5份，按方法中色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參新酮、丹酚酸B、迷迭香酸峰面積平均值分別為10 379×103、61 146×103、13 677×103、96 462×103、4 398×103、189 961×103、15 222×103。RSD分別為3.9%、3.0%、2.8%、2.5%、2.5%、2.2%、1.8%。

2.5 回收率測定

取已知含量丹參樣品，二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參新酮、丹酚酸B、迷迭香酸含量分別為0.30、1.16、1.37、5.13、0.29、35.26、1.12 mg·g-1，根據(jù)測定方法稱取1 g已知含量丹參樣品(水溶性物質(zhì)測定稱取0.1 g)，分別加入0.3、1.2、1.4、5.0、0.3、3.5、0.1 mg對照樣品，后按照方法進(jìn)行提取測定，測得峰面積平均值分別為19 661×103、12 3624×103、29 364×103、201 633×103、9 132×103，樣品回收率分別為108%、97.7%、113%、108%、99.8%、90.9%、91%。

2.6 樣品測定

分別取不同生長年限的樣品，按上述方法測定二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參新酮、丹酚酸B、迷迭香酸的峰面積，分別按干燥品計(jì)算含量。

采用最小差異顯著法進(jìn)行多重比較分析，其中A, B, C表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；a, b, c表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2為不同生長年限丹參中脂溶性成分的含量。結(jié)果表明，1年生白花丹參中脂溶性成分均比2年生含量高，其中隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參新酮含量分別比2年生丹參高110.0%、33.3%、78.4%、100%。生長年限對白花丹參中5種脂溶性成分的影響率為隱丹參酮>丹參新酮>丹參酮ⅡA>丹參酮Ⅰ>二氫丹參酮。

生長年限對紫花丹參中各脂溶性成分的影響不一致，其中2年生丹參中丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的含量高于1年生，二氫丹參酮、隱丹參酮和丹參新酮的含量則以1年生為高。

相同生長年限的不同丹參比較結(jié)果表明，紫花丹參脂溶性成分含量均比相同生長年限的白花丹參含量高。1年生白花丹參5種脂溶性成分總含量為6.18 mg·g-1，2年生總含量為3.63 mg·g-1，而1年生紫花丹參5種脂溶性成分總含量為7.08 mg·g-1，2年生總含量為7.06 mg·g-1。

表3為不同生長年限丹參中水溶性成分的含量比較。結(jié)果表明，生長1～2年對白花丹參中2種水溶性成分影響不一致。2年生白花丹參中迷迭香酸的含量明顯高于1年生，而丹酚酸B的含量差異不明顯。

表2 不同生長年限丹參脂溶性成分含量測定 /mg·g-1

注：大寫字母表示P<0.01，小寫字母表示P<0.05，下同。

紫花丹參中兩種水溶性成分均以2年生含量較高，丹酚酸B和迷迭香酸的含量分別比1年生高25.1%和58.7%，差異水平均達(dá)到極顯著。

1年生白花中丹酚酸B的含量明顯高于紫花丹參，但迷迭香酸含量低于紫花丹參；2年生紫花丹參中的丹酚酸B和迷迭香酸含量均顯著高于白花丹參。

表3 不同生長年限丹參水溶性成分含量測定 /mg·g-1

不同丹參其活性成分含量存在差異，李正國[8]研究結(jié)果表明，紫花丹參和白花丹參脂溶性成分總含量8月份最高，分別為1.02%和1.21%；徐翠紅[9]研究結(jié)果表明，各有效成分在紫花丹參和白花丹參中的變化規(guī)律基本一致，但總體上白花丹參各藥用成分含量大于紫花丹參。本研究表明，1年生白花丹參的二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的含量明顯低于1年生的紫花丹參，而丹酚酸B的含量明顯高于紫花丹參；對2年生白花丹參而言，其5種脂溶性成分以及2種水溶性成分含量均低于相同年限的紫花丹參；除迷迭香酸含量外，1年生白花丹參脂溶性成分均高于2年生，所以白花丹參以1年生質(zhì)量為佳；而2年生紫花丹參水溶性成分的含量明顯高于1年生。

藥用植物有效成分的合成積累與環(huán)境因子密切相關(guān)，土壤、溫度、光照、水分等環(huán)境條件通過單一或相互作用影響著藥用植物的品質(zhì)[10]，在種源明確的條件下，環(huán)境因子是控制人工栽培藥材成功與否的關(guān)鍵。1～2年生白花丹參除丹酚酸B外其他活性成分均低于紫花丹參，說明白花丹參更適合于取樣地點(diǎn)的砂質(zhì)土壤，而紫花丹參在此條件下處于逆境狀態(tài)，更有利于合成次生代謝物質(zhì)。

3 結(jié)論

3.1 生長年限對白花丹參的影響

生長年限對白花丹參的影響主要表現(xiàn)在脂溶性物質(zhì)上，1年生白花丹參中隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和丹參新酮4種成分的含量均高于2年生丹參，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；生長年限對白花丹參中水溶性成分的影響主要表現(xiàn)在迷迭香酸上，2年生白花丹參的迷迭香酸含量明顯高于1年生。

3.2 生長年限對紫花丹參的影響

生長年限對紫花丹參中各脂溶性成分的影響不一致，水溶性成分以2年生為高。

3.3 相同年限不同丹參活性成分比較

1～2年生紫花丹參中脂溶性成分和迷迭香酸含量高于相同年限的白花丹參，1年生丹參丹酚酸B的含量以白花丹參為高，而2年生則以紫花丹參為高。

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InfluenceofDifferentGrowthYearonActiveConstituentsinSalviamiltiorrhizaBge.andSalviamiltiorrhizaBge.F.alba.

LIU Wei1, LIU Jian-hua1, ZHOU Jie1, WANG Xiao1, GENG Yan-ling1，LI Feng-sheng2

(1.ProcessControlResearchCenterofTCM,SDAS/ShandongAnalysisandTestCenter,Jinan, 250014,China;2.LaiwuZiGuangecologicalcompany,Laiwu271100,China)

Objective:To study the influence of different growth year on the content of active constituents inSalviamiltiorrhizaBge. andSalviamiltiorrhizaBge. F. alba..MethodsHPLC method was used to determine the contents of the liposoluble constituents(Dihydrotanshinone, Cryptotanshinone, Tanshinone, TanshinoneⅡA, Miltione) and water-soluble constituents(Salvianolic acid, Rosemarinic acid).ResultsContents of liposoluble constituents in both one- and two-year-oldSalviamiltiorrhizaBge. F. alba. were 6.18 mg·g-1and 3.63 mg·g-1while 7.08 mg·g-1and 7.06 mg·g-1inSalviamiltiorrhizaBge., respectively. Contents of water-soluble constituents in both one-and two-year-oldSalviamiltiorrhizaBge. F. alba. were 44.44 mg·g-1and 43.19 mg·g-1while 38.89 mg·g-1and 49.12 mg·g-1inSalviamiltiorrhizaBge., respectively.ConclusionThe quality of one year ofSalviamiltiorrhizaBge. F. alba. was better than 2 years’，The quality ofSalviamiltiorrhizaBge. was better thanSalviamiltiorrhizaBge. F. alba. when planted in sand soil.

SalviamiltiorrhizaBge.; Growth years; Content; Active constituents

2012-08-28)