劉修樹(shù)，周晶，何曉麗，方麗波，湯潔

(1.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 合肥 238000；2.安徽省中醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

中藥工業(yè)

安徽省教育廳質(zhì)量工程省級(jí)特色專(zhuān)業(yè)(皖教高[2010]28號(hào))

*

劉修樹(shù)，Tel：(0565)2364330，E-mail：shuxliu@126.com

超臨界-CO2法萃取苦參中苦參堿的工藝優(yōu)化△

劉修樹(shù)1*，周晶2，何曉麗1，方麗波1，湯潔1

(1.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 合肥 238000；2.安徽省中醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

目的探討超臨界-CO2法萃取苦參中苦參堿最佳工藝。方法采用HPLC測(cè)定含量，以萃重和苦參堿含量為考察指標(biāo)，運(yùn)用單因素和正交試驗(yàn)法優(yōu)選萃取工藝。結(jié)果選擇75%的乙醇作為夾帶劑，按4倍量加入，CO2流量對(duì)苦參堿萃取量有顯著的影響，其次是萃取壓力和萃取時(shí)間。結(jié)論超臨界-CO2法萃取苦參中苦參堿最佳工藝是萃取壓力25 MPa、萃取溫度60 ℃、萃取時(shí)間3 h、CO2流量40 kg·h-1。

超臨界-CO2法；苦參；苦參堿；工藝優(yōu)化

苦參堿(Matrine)是存在于苦參SophoraflavescensAit.、苦豆子SophoraalopecuroidesL.、山豆根SophoratonkinensisGapoep等多種豆科植物中有效成分生物堿的一種?，F(xiàn)代研究表明苦參堿具有抗腫瘤、抗纖維化、抗炎、抗病毒及對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多種藥理作用[1-2]。目前苦參堿制劑在臨床上主要聯(lián)合用藥治療肝性疾病，尤其病毒性肝炎[3]。從苦參中提取分離苦參堿的方法有多種，以超臨界-CO2法萃取分離苦參堿國(guó)內(nèi)也有文獻(xiàn)報(bào)道[4]，但未對(duì)工藝進(jìn)一步研究。本文以HPLC法測(cè)定苦參堿含量，萃重、苦參堿含量作為參考指標(biāo)，分別采用單因素法對(duì)夾帶劑乙醇的濃度、加入量進(jìn)行考察，用正交設(shè)計(jì)法對(duì)影響超臨界-CO2法萃取分離苦參堿的因素進(jìn)行了考察，從而獲得超臨界-CO2法萃取分離苦參堿的最佳工藝。

1 儀器與試藥

1.1 藥品

苦參藥材購(gòu)自亳州北京同仁堂飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)鑒定為SophoraflavescensAit.的根，苦參堿對(duì)照品(西安中鑫生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：060119，含量>99%)。

1.2 儀器與試劑

KQ-50DE型數(shù)控超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)，RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵(河南鞏義市英峪予華儀器廠)，DZF-6020型真空干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)，HL-5L/50 MPa-ⅡCWQ型超臨界流體(CO2)萃取裝置(杭州華黎泵業(yè)有限公司),AG-285型十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多)，島津LC-10AT高效液相色譜儀；島津SPD-10Avp紫外檢測(cè)器；浙江N2010色譜工作站。

CO2購(gòu)自合肥氧氣站(純度>99%)，乙腈、無(wú)水乙醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 超臨界萃取方法

將苦參堿藥材粉碎后過(guò)60目篩，稱(chēng)取藥粉300 g 倒入2 000 mL的大燒杯中，加500 mL 0.5 mL·L-1氨水溶液浸潤(rùn)過(guò)夜，次日投入萃取釜中。超臨界萃取采用一次加料、一級(jí)萃取、二級(jí)分離、超臨界CO2連續(xù)流動(dòng)，萃取過(guò)程按一定速率分3次注入夾帶劑，萃取至1.5 h第一次收集萃取液，以后每隔30 min 收集一次，直至無(wú)萃取液產(chǎn)生，合并收集的萃取液，過(guò)濾，減壓回收溶劑，60 ℃真空干燥得萃重。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 ZORBAX NH柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相：乙腈-無(wú)水乙醇-1%磷酸溶液(75∶10∶15),流速：0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：(V/V)220 nm,進(jìn)樣量：20 μL；柱溫為室溫,理論塔板數(shù)不低于4 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取經(jīng)P2O5干燥至恒重的苦參堿對(duì)照品10 mg于10 mL棕色的容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，制成每毫升含1 mg苦參堿的溶液，即為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別稱(chēng)取苦參堿萃取物約0.25 g，精密稱(chēng)定，加入25 mL容量瓶中，用氨水調(diào)甲醇pH=10左右，用該堿性甲醇20 mL溶解萃取物，并超聲攪拌30 min，堿性甲醇定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 外標(biāo)法測(cè)定含量。分別精密量取對(duì)照品溶液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL置于10 mL的棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進(jìn)樣20 μL，以苦參堿含量為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算得回歸方程Y=2 005.2X+120.8，r=0.999 9?？鄥A在50～300 μg·mL-1與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，求得苦參堿含量，計(jì)算RSD=0.58%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品溶液按樣品測(cè)定的步驟進(jìn)行操作，每1 h測(cè)定1次。結(jié)果分別為11.96，12.35，12.11，12.46，12.43，12.27，12.39 mg·g-1，平均含量為12.28 mg·g-1，RSD=1.47%(n=7)。表明供試品溶液至少在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取3份已知含量的超臨界樣品溶液3 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，加入對(duì)照品溶液適量，用甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，按樣品分析方法進(jìn)行測(cè)定。3份苦參堿回收率分別為98.1%，99.6%，98.5%，平均回收率為98.7%，RSD=0.79%。

2.2.8 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取超臨界萃取物同一試樣，按2.2.3項(xiàng)下方法制成供試液，依照色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定苦參堿含量，平均含量為12.25 mg·g-1，RSD=0.41%。

2.3 結(jié)果與分析

2.3.1 夾帶劑的選擇 由于苦參堿極性較大,不加入夾帶劑時(shí)苦參堿萃取率較低,甚至不能萃取出,因而夾帶劑選擇顯得非常重要。夾帶劑種類(lèi)較多,考慮夾帶劑對(duì)萃取成分的溶解特性和毒性、以及對(duì)設(shè)備的腐蝕和環(huán)境的影響,在參閱相關(guān)文獻(xiàn)[5]的基礎(chǔ)上直接選擇價(jià)格低廉、安全性好的乙醇作為夾帶劑,考察了不同濃度的乙醇及其加入的量(與物料體積重量比)對(duì)萃取效果的影響。

2.3.2 乙醇濃度選擇 為了進(jìn)一步考察不同乙醇濃度對(duì)超臨界萃取的影響，分別選擇95%，85%，75%，65% 4種不同濃度的乙醇作為夾帶劑,夾帶劑與超臨界CO2流體同步泵入萃取器內(nèi),加入量是物重的3倍,結(jié)果苦參堿含量分別為9.26，11.15，15.37，8.94 mg·g-1?？梢钥闯鲆掖嫉臐舛葘?duì)苦參堿的萃取率影響較大,乙醇濃度影響程度大小依次為：75%乙醇>85%乙醇>95%乙醇>65%乙醇，故選用75%乙醇作為夾帶劑。

2.3.3 夾帶劑75%乙醇不同加入量的試驗(yàn)研究 分別選擇夾帶劑75%乙醇2，3，4，5倍加入量(與物料體積重量比)，超臨界萃取苦參堿含量分別為12.36，14.07，16.92，14.19 mg·g-1?？梢钥闯?5%乙醇的加入量對(duì)苦參堿的萃取效果影響較顯著，最佳加入量為4倍量。

2.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)，根據(jù)影響超臨界CO2萃取的各種因素條件，選擇4種主要因素萃取壓力(A)、溫度(B)、時(shí)間(C)、CO2流量(D)，采用正交試驗(yàn)的方法來(lái)確定最佳萃取條件，因素水平表見(jiàn)表1。選用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)，以萃取物苦參堿含量為試驗(yàn)考察指標(biāo)，萃重平均值作為參考，每號(hào)試驗(yàn)做3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析見(jiàn)表2、3。

表1 苦參堿超臨界CO2萃取正交試驗(yàn)因素水平表

表2 苦參堿超臨界CO2萃取正交試驗(yàn)表

表3 方差分析表

注：(1)n=2,(2)F0.01(2，18)=6.01,F0.05(2，18)=3.55

表2極差值直觀分析得出，D因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最顯著，其他影響因素大小依次為B>A>C。表3方差分析，D因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最顯著，其他因素依次為B>A>C，與直觀分析一致，結(jié)合兩者獲得最佳萃取工藝為A2B3C3D3，即萃取壓力25 MPa、萃取溫度60 ℃、萃取時(shí)間3 h、CO2流量40 kg·h-1。

2.3.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,按最終確定的萃取苦參堿最佳工藝條件做3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果分別為22.97，24.06，24.23 mg·g-1，與正交試驗(yàn)結(jié)果較一致,說(shuō)明此工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

雖然藥材的粉碎度越高，萃取率也越高，但粉碎度過(guò)高，在萃取過(guò)程中容易產(chǎn)生堵塞現(xiàn)象。選擇20目、40目、60目、80目、100目5種不同苦參粉末預(yù)實(shí)驗(yàn)，80目、100目的粉末易堵塞，不利于超臨界萃取，20目、40目、60目苦參粉末中60目粉末萃取苦參堿率較高，萃重與20目、40目的萃重相近，故選擇60目苦參粉末。

夾帶劑采用一次性連續(xù)加入，分兩次和3次的方式加入(分次加入的時(shí)間間隔為0.5 h)，以分3次的方式加入的苦參堿的萃取率較好，3次量按2∶1∶1的比例加入。

[1] 孟慶紅，張玲，張喜云,等.苦參的藥理研究進(jìn)展[J].航空航天醫(yī)藥，2009，20(2)：125-126.

[2] 王磊，李慶林.苦參堿抗腫瘤作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥，2009,13(4)：360-362.

[3] 金丙雄.苦參堿聯(lián)合用藥治療慢性乙型肝炎的新進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2011，24(12)：1409-1410.

[4] 葛發(fā)歡，黃星，譚曉華，等.非離子表面活性劑對(duì)超臨界CO2從苦參中萃取苦參堿類(lèi)的影響[J].中藥材，2003，26(6)：426-427.

[5] 高洪燕，張?jiān)?心律寧片劑中氧化苦參堿的萃取及其含量測(cè)定的研究[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2011，1(13)：50-51.

OptimizationofExtractingProcessofMatrineinSophoraeFlavescentisRadixbySupercriticalCO2

LIU Xiu-shu1, ZHOU Jing2,HE Xiao-li1,FANG Li-bo1,TANG jie1

(1.HefeiVcationalandTechnicalCollege,Hefei238000,China;2.TraditionalChineseMedicalHospitalinAnhui,Hefei230031,China)

Objective:Select a best process of Matrine in Sophorae Flavescentis Radix by supercritical CO2.MethodsHPLC is the method of content determination.Extraction technology was optimized by the extraction weight and the content of Matrine in single factor and orthogonal design.Results75% ethanol was elected as entraining agent. Addition capacity is 4 times of volume. Compared with the other three factors, the quantity of flow of CO2has more influence on extraction, The next influencing factors are pressure and time of extraction.ConclusionThe best extracting process by supercritical CO2was 25 MPa, 60 ℃, 3 h, quantity of flow of CO240 kg·h-1.

Supercritical CO2; Sophorae Flavescentis Radix; Matrine; Optimization of extracting process

2012-01-05)