盧旱云 吳 鐵 鄭志明

廣東醫(yī)學(xué)院藥理教研室，廣東湛江 524023

腦栓通膠囊對(duì)癡呆小鼠腦組織MAO及海馬神經(jīng)元的影響

盧旱云△吳 鐵▲鄭志明

廣東醫(yī)學(xué)院藥理教研室，廣東湛江 524023

目的 研究腦栓通膠囊對(duì)D-半乳糖所致癡呆小鼠腦組織MAO及海馬神經(jīng)元的影響。 方法 將36只小鼠隨機(jī)均分為正常對(duì)照組、模型組、腦栓通膠囊組和腦復(fù)康陽(yáng)性對(duì)照組。模型組、腦栓通膠囊組和腦復(fù)康陽(yáng)性對(duì)照組每天皮下注射D-半乳糖120 mg/kg，連續(xù)注射6周；正常對(duì)照組每天皮下注射同等體積的生理鹽水；模型對(duì)照組與正常對(duì)照組每天灌胃等量的生理鹽水，腦栓通膠囊組灌胃量1.35粒/（kg·d），腦復(fù)康組灌胃量0.36 g/（kg·d）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)定腦組織MAO活性及光鏡下觀察小鼠大腦海馬形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)果 模型組小鼠腦組織MAO活性升高，海馬區(qū)出現(xiàn)病理形態(tài)學(xué)改變，經(jīng)腦栓通膠囊治療后小鼠腦組織MAO活性降低，形態(tài)學(xué)病理改變減輕，與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 初步表明腦栓通膠囊能降低MAO活性，保護(hù)海馬神經(jīng)元，可用于預(yù)防和治療MAO活性增高導(dǎo)致的相關(guān)疾病。

D-半乳糖；腦栓通膠囊；小鼠；MAO；海馬神經(jīng)元

腦栓通膠囊是活血化瘀復(fù)方中藥，由蒲黃、赤芍、郁金、天麻、漏蘆組成。具有降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降低血壓、降低血黏度、抑制血小板凝集、抗血栓形成、增加腦血流量、抗自由基脂質(zhì)過(guò)氧化、減少缺血性腦梗死的梗塞面積等藥理作用[1]。臨床常用于風(fēng)痰瘀血痹阻脈絡(luò)引起的缺血性中風(fēng)中經(jīng)絡(luò)急性期和恢復(fù)期；但對(duì)老年性癡呆是否有預(yù)防和治療作用，目前還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。基于腦栓通膠囊具有抗自由基脂質(zhì)過(guò)氧化、清除自由基、保護(hù)腦等作用，本研究采用D-半乳糖建立老年性癡呆動(dòng)物模型，觀察腦栓通膠囊對(duì)D-半乳糖所致癡呆模型小鼠腦組織MAO及海馬神經(jīng)元的影響，觀察其是否具有抗老年癡呆的作用，為腦栓通膠囊用于老年性癡呆的預(yù)防及治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠36只，雌雄各半，體重 18～22 g，由廣州穗北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2002-0003。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑

腦栓通膠囊（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，Z20040093）0.4 g/粒。由蒲黃、赤芍、郁金、天麻、漏蘆五味中藥組成。吡拉西坦片（腦復(fù)康，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，H44020779）。 D-半乳糖（Amresco公司，20100105349），MAO試劑盒（南京建成生物工程研究所），HE染液試劑盒（南京建成生物工程研究所），其他試劑為市售分析純（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

1.3 儀器

Leica石蠟切片機(jī)（leica公司，Leica2155）；顯微鏡（Nikon eclipse 80i，Japan）；JJ500型電子分析天平（MC，江蘇常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；酶標(biāo)儀（Biotek，USA）；離心機(jī)（eppendorf，centrifuge 5810 R）；漩渦混合器（Maxi mixⅡ，Barnstead/Thermolyne）。

1.4 方法

將36只小鼠隨機(jī)均分為正常對(duì)照組（n=10）、模型組（n=10）、腦栓通膠囊組（n=10）和陽(yáng)性對(duì)照腦復(fù)康組（n=6）。模型組、腦栓通膠囊組、腦復(fù)康組每天給予皮下注射D-半乳糖120 mg/kg，連續(xù)注射6周，每周稱重1次。正常對(duì)照組每天皮下注射同等體積的生理鹽水。模型對(duì)照組與正常對(duì)照組每天灌胃生理鹽水，腦栓通膠囊組每天灌胃1.35粒/（kg·d），腦復(fù)康組灌胃量0.36 g/（kg·d）。于造模給藥第42天，眼球取血處死動(dòng)物。在4℃冰浴條件下迅速取腦，去除嗅球、小腦及腦干，生理鹽水清洗后濾紙吸干于電子分析天平稱重，記錄腦總重量。分開(kāi)左右腦，右腦放置于密封袋中置冰箱中保存待測(cè)生化指標(biāo)，左腦泡10%中性福爾馬林固定待腦切片觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)改變。稱右腦加9倍冰生理鹽水制成10%腦勻漿備用，并按照南京建成生物工程研究所MAO試劑盒說(shuō)明用酶標(biāo)儀測(cè)定腦組織的MAO活性。4 d后取左腦常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，冠狀切片，片厚5μm，制好片于60℃烘烤1 h后HE染色。染色后通過(guò)顯微鏡選取海馬CA1、CA2、CA3及齒狀回各區(qū)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 腦栓通膠囊對(duì)小鼠體重的影響

正常組前2周體重輕度下降，第3周開(kāi)始體重有所回升并趨于平衡。模型組前3周體重下降較明顯，第4周開(kāi)始體重有所回升但不明顯，整個(gè)給藥期間這一組的體重都比其他組輕。腦栓通膠囊組前2周體重上升，第3周開(kāi)始至第5周體重下降得較明顯，其間與模型組比較體重有增加的趨勢(shì)，第6周開(kāi)始體重有所回升。腦復(fù)康組體重變化不大，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程在1 g范圍內(nèi)波動(dòng)。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 腦栓通膠囊對(duì)小鼠體重的影響

2.2 腦栓通膠囊對(duì)小鼠腦總重量和MAO活性的影響

模型組腦重減輕，腦組織MAO活性升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)腦栓通膠囊治療后腦重增加，MAO活性下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腦復(fù)康組腦重與正常組、模型組比較未見(jiàn)顯著差異，但腦組織MAO活性升高，與正常組、模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 腦栓通膠囊對(duì)小鼠腦總重量和MAO活性的影響（± s）

表2 腦栓通膠囊對(duì)小鼠腦總重量和MAO活性的影響（± s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

MAO[U/（h·mgprot）]正常組 10 - 0.300±0.020 2.83±1.88模型組 10 - 0.280±0.017* 6.90±4.86*腦栓通膠囊組 10 1.35粒/（kg·d） 0.297±0.016△ 3.01±1.02△腦復(fù)康組 6 0.36 g/（kg·d） 0.290±0.018 17.24±2.31**△△組別 n 劑量 腦組織的總重量（g）

2.3 腦栓通膠囊對(duì)癡呆小鼠腦組織海馬各區(qū)的影響

2.3.1 低倍鏡下腦栓通膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠腦組織海馬各區(qū)的影響 低倍鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組海馬結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)細(xì)胞排列緊密，層次清楚、結(jié)構(gòu)清晰，CA3區(qū)有少量神經(jīng)細(xì)胞核深染（2-A、3-A）；模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，層次減少，尤其CA1區(qū)排列較正常組疏松，且CA1、CA2、CA3 和齒狀回各區(qū)均見(jiàn)大量神經(jīng)元細(xì)胞核深染，與空白對(duì)照組相比有顯著差異（2-B、3-B）；腦栓通膠囊組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較模型組有所增加，層次較清，亦見(jiàn)CA3區(qū)有少量神經(jīng)細(xì)胞核深染，與空白對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異（2-C、3-C）；腦復(fù)康組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目同樣較模型組有所增加，層次較清，亦見(jiàn)CA3區(qū)有少量神經(jīng)細(xì)胞核深染，與空白對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異（2-D、3-D）。見(jiàn)圖 2～ 3。

2.3.2 高倍鏡下腦栓通膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠腦組織海馬CA1、CA2、CA3及齒狀回各區(qū)的影響 高倍鏡下（4-A、5-A、6-A）正常對(duì)照組CA1、CA2、CA3神經(jīng)元細(xì)胞體大、豐滿、圓潤(rùn)，胞漿豐富,細(xì)胞核清晰,細(xì)胞間排列整齊,界限清楚，齒狀回（DG）可見(jiàn)少量變性細(xì)胞核深染；模型組與正常對(duì)照組比較CA1、CA2、CA3及齒狀回神經(jīng)元數(shù)目明顯減少,可見(jiàn)大量的神經(jīng)元細(xì)胞核固縮、壞死、深染，細(xì)胞間排列疏松，界限模糊，偶見(jiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬現(xiàn)象（4-B、5-B、6-B）；腦栓通膠囊組海馬各區(qū)與正常對(duì)照組比較未見(jiàn)顯著差異，神經(jīng)元數(shù)目較多,細(xì)胞體大、豐滿、圓潤(rùn)、形態(tài)規(guī)則,細(xì)胞核清晰，偶見(jiàn)少量變性細(xì)胞散在其間，細(xì)胞間排列較整齊，界限較清楚（4-C、5-C、6-C）；腦復(fù)康組海馬各區(qū)與正常對(duì)照組比較亦未見(jiàn)顯著差異（4-D、5-D、6-D）。見(jiàn)圖4～6。

表1 腦栓通膠囊對(duì)小鼠體重的影響（± s，g）

表1 腦栓通膠囊對(duì)小鼠體重的影響（± s，g）

注：與模型組比較，△P＜0.05

組別 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周 第6周正常組 29.43±3.63 28.46±2.57 29.24±3.12 29.5±3.13 29.69±3.14 29.69±3.29模型組 28.5±2.59 27.52±3.17 27.03±3.62 27.39±2.95 27.76±2.66 28.15±2.39腦栓通膠囊組 30.99±4.24 31.46±4.11△ 30.64±4.31△ 30.04±3.69 29.49±3.57 30.58±3.06腦復(fù)康組 31.09±3.77 30.51±3.65 30.03±3.74 30.17±3.51 30.72±4.07 29.51±4.33

圖2 癡呆小鼠低倍鏡下形態(tài)圖（HE×40）

圖3 癡呆小鼠低倍鏡下形態(tài)圖（HE×100）

圖4 癡呆小鼠CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞圖（HE×400）

圖5 癡呆小鼠CA2-CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞圖（HE×400）

圖6 癡呆小鼠齒狀回神經(jīng)細(xì)胞圖（HE×200）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠皮下注射D-半乳糖（120 mg/kg），連續(xù)注射6周，小鼠腦組織出現(xiàn)海馬神經(jīng)元的病理改變及MAO活性升高。實(shí)驗(yàn)中筆者通過(guò)HE染色后光鏡下不同倍數(shù)觀察了海馬CA1、CA2、CA3及齒狀回各區(qū)的神經(jīng)形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)模型組海馬CA1、CA2、CA3及齒狀回神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，表現(xiàn)為HE染色后神經(jīng)細(xì)胞核深染，固縮、壞死，核膜界限不清，CA1偶見(jiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬現(xiàn)象，與正常組比較有顯著差異；腦組織生化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MAO活性升高。Folstein M等[2]研究證明海馬與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，而學(xué)習(xí)記憶障礙是腦老化的一種重要表現(xiàn)。因此，海馬成為腦衰老研究的重要指標(biāo)。MAO是大腦周圍神經(jīng)組織中一種十分重要的酶，不僅能提高有害的H2O2的水平，而且可以使單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量下降，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的老化過(guò)程[3]。王鵬琴等[4]研究顯示，AD患者腦組織中MAO活性升高，氧化分解單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，影響學(xué)習(xí)及注意力。而衰老是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受許多生理病理因素的影響。其中“衰老的自由基理論”是目前比較公認(rèn)的學(xué)說(shuō)[5]。Pauwels EK、Rossi L等[6-7]研究表明，氧自由基引起的損傷所導(dǎo)致的細(xì)胞功能紊亂在其中起著重要作用，而腦組織耗氧量較大及其含有單胺氧化酶等特性，導(dǎo)致氧自由基引起的損傷在腦組織更為明顯。本研究中，模型腦組織MAO活性升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），代表模型的復(fù)制已造成與AD相關(guān)的氧化損傷。

經(jīng)腦栓通膠囊治療后，小鼠腦組織海馬神經(jīng)的病理改變得到改善，神經(jīng)元數(shù)目較多，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核清晰，偶見(jiàn)少量變性細(xì)胞散在其間，細(xì)胞間排列較整齊，界限較清楚；腦組織生化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)癡呆小鼠MAO活性降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 據(jù)現(xiàn)代藥理研究和長(zhǎng)期臨床觀察表明，腦栓通膠囊具有降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降低血壓、降低血黏度、抑制血小板凝集、抗血栓形成、增加腦血流量、抗自由基脂質(zhì)過(guò)氧化、減少缺血性腦梗死的梗死面積等藥理作用[1]，通常用于風(fēng)痰瘀血痹阻脈絡(luò)引起的缺血性中風(fēng)中經(jīng)絡(luò)急性期和恢復(fù)期；癥見(jiàn)半身不遂，口舌歪斜，脈沉細(xì)或弦細(xì)，弦沒(méi)；腦梗死上見(jiàn)述表現(xiàn)者。目前西醫(yī)對(duì)老年癡呆的治療仍無(wú)令人滿意的藥物，雖然有些藥物有一定效果，但療程長(zhǎng)、費(fèi)用高，給患者家庭及社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，有針對(duì)性地開(kāi)發(fā)研制切實(shí)有效的防治藥物已迫在眉睫。查文獻(xiàn)腦栓通膠囊用于治療老年癡呆未曾報(bào)道，基于腦栓通膠囊具有抗自由基脂質(zhì)過(guò)氧化，清除自由基、保護(hù)腦等作用，筆者觀察了腦栓通膠囊對(duì)D-半乳糖所致衰老模型小鼠腦組織MAO及海馬神經(jīng)元的影響，發(fā)現(xiàn)其具有降低癡呆小鼠腦組織MAO活性和改善癡呆小鼠腦組織病理改變的作用，這一發(fā)現(xiàn)在原有藥物的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)其新用途，為腦栓通膠囊用于癡呆治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。初步表明中藥腦栓通膠囊能通過(guò)提高腦組織抗氧化性和清除自由基的能力來(lái)改善癡呆小鼠腦組織的形態(tài)病理改變。

經(jīng)腦復(fù)康治療后，小鼠腦組織海馬各區(qū)與正常對(duì)照組、腦栓通膠囊組比較未見(jiàn)顯著差異，神經(jīng)元數(shù)目較多，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核清晰，偶見(jiàn)少量變性細(xì)胞散在其間，細(xì)胞間排列較整齊，界限較清楚。但腦組織MAO活性升高，原因有待進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

本研究證明了給小鼠連續(xù)皮下注射6周D-半乳糖可致小鼠腦組織MAO活性升高，海馬神經(jīng)出現(xiàn)病理改變，腦栓通膠囊對(duì)D-半乳糖導(dǎo)致的癡呆小鼠腦組織的這種改變有一定的對(duì)抗作用，提示腦栓通膠囊可作為單胺氧化酶的抑制劑，用于預(yù)防和治療腦組織單胺氧化酶過(guò)高的疾病。

[1]李儀奎，姜名瑛.中藥藥理學(xué)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)學(xué)出版社，1992：198.

[2] Folstein M，F(xiàn)olstein S.Functional expressions of the aging brain[J].NutrRev，2010，68（Suppl 2）：S70-73.

[3] 殷瑩，田清淶.單胺氧化酶及其抑制劑與老年神經(jīng)變性疾病[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，1998，12（3）：122.

[4] 王鵬琴，王麗波，曹鳳武.眼針療法對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及海馬組織乙酰膽堿酯酶活性的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2004，22（4）：731.

[5] Harman D.Aging：a theory based on free radical and radiation chemistry[J].J Gerontol，1957（2）：298-300.

[6] Pauwels EK，Erba PA，Kostkiewicz M.Antioxidants：a tale of two stories[J].Drug News Perspect，2007，20（9）：579-585.

[7] Rossi L，Mazzitelli S，Arciello M，et al.Benefits from dietary polyphenols for brain aging and Alzheimer's disease[J].Neurochem Res，2008，33（12）：2390-2400.

The influence of naoshuantong capsule on MAO and hippocampal neuron in aging model mice's brain

LU Hanyun WU Tie ZHENG Zhiming
Department of Pharmacology,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023,China

ObjectiveTo observe the influence of naoshuantong capsule on MAO and hippocampal neuron in ageing model mice's brain induced by D-galactose.Methods36 mice were randomly divided into 4 groups:blank group,model group,naoshuantong capsule group and piracetam positive control group.The mice in blank group were subcutaneous injected with the same volume of saline,The others group were administrated with D-galactose 120 mg/(kg·d)for successive 6 weeks.Simultaneous,mice in blank and model groups were daily administrated with the same dose of saline while the naoshuantong capsule group was administrated with 1.35 pellet/(kg·d) and the piracetam positive control group was fed with 0.36 g/(kg·d) .After 42 days,the mice were killed and taken the brain.The activity of MAO in hippocampus of mices were detected and hippocampal neuronal structures were observed by light microscope.ResultsThe content of MAO increased and appeared pathological morphology change in the hippocampal structures in the model group.After treated with naoshuantong capsule the content of MAO was reduced and the morphological pathological change was alleviated.Compared with the blank group,there was no significant difference.ConclusionIt preliminarily indicates that naoshuantong capsule can reduce MAO activity,protect hippocampal neuron and can be used for the prevention and treatment in related diseases induced by MAO increased.

D-galactose;Naoshuantong capsule;Mice;MAO;Hippocampal neuron

R-332

A

2095-0616（2012）11-30-04

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010B060500014）。△廣東醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)2011級(jí)在讀碩士研究生

▲通訊作者

2012-05-04）