丁 宇，阮狄克，何 勍，王超鋒

鑒于脊柱融合術(shù)后易導(dǎo)致鄰近節(jié)段的退變，異體椎間盤移植(total disc allografting，TDA)等椎間關(guān)節(jié)成形術(shù)近年來得以快速發(fā)展，系列動物實驗及一期臨床研究均證實了TDA 作為自然生物椎間盤移植的有效性［1-2］。然而，異體組織材料在臨床的應(yīng)用過程中還應(yīng)考慮到其安全性，即盡量減少諸如肝炎、HIV 等病毒，細菌或真菌等所致疾病傳播的可能性。另外，隨著椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)生物學(xué)治療的發(fā)展，諸如組織工程構(gòu)建椎間盤、基因治療、間充質(zhì)干細胞移植等均具有令人鼓舞的應(yīng)用前景［3-4］，人們期望找到一種可靠的生物支架用于椎間盤疾病的相關(guān)研究。本研究通過比格犬動物實驗，旨在評價經(jīng)γ 射線照射致去細胞化異體椎間盤的生物學(xué)特性，進而探討其作為生物椎間盤支架的可行性。

1 材料與方法

1.1 標本來源

共選擇6 只比格犬，動物實驗方案事先得到醫(yī)院動物實驗道德委員會批準。所有犬實驗前均行X線檢查，以排除脊柱疾患的可能。應(yīng)用超劑量戊巴比妥鈉(1 mL/kg)靜脈注射處死實驗動物，并獲取盡可能長的脊柱節(jié)段。

1.2 實驗分組

胸腰椎脊柱節(jié)段被分解并隨機分為4組:1 個對照組(椎間盤未被照射處理)及3 個處理組(不同劑量射線照射處理)。每組含有12 個實驗樣本，其中6 個樣本用于細胞活性檢測(主要為胸椎)，另外6 個樣本用于生物力學(xué)測試(主要為腰椎)。射線照射劑量分為18 kGy，25 kGy 及50 kGy 3 個等級，照射完畢后各實驗組標本立即送往細胞檢測，并盡早行生物力學(xué)測試。

1.3 實驗方法

1.3.1 椎間盤準備及冷凍

盡量去除脊柱標本周圍的肌肉、韌帶等附著組織，分別于距離上下終板1～2 mm 處截斷椎體，實驗過程中不斷用0.9%生理鹽水噴灑標本以保持其濕度。實驗中采用逐級冷度的方法進行標本處理，首先將獲取的椎間盤標本用生理鹽水洗凈，然后浸于RPMI-1640 冷凍保存液中(10% 二甲基亞砜+10%小牛血清)，處理后標本冷藏于4℃冰箱中。繼而，標本保存在－15℃環(huán)境中1 h、－40℃環(huán)境中1 h，最終儲存于－80℃低溫冰柜中3周。

1.3.2 射線輻射

椎間盤接受60Co 源照射(北京大學(xué)鈷源控制中心)，標本周圍放置干冰以保持低溫環(huán)境，控制照射劑量分別為18 kGy，25 kGy 及50 kGy。在照射過程中，將標本袋置于照射空間中心位置，以保證整個標本接受均勻強度的射線輻射處理，輻射量計放置于標本附近以檢測實際輻射劑量。

1.3.3 移植椎間盤細胞活性的檢測

用于細胞活性檢測的椎間盤組織應(yīng)及時嚴密包裝，并于0.5 h 內(nèi)送往檢測實驗室。將凍存管直接浸泡于37℃水浴中復(fù)溫(復(fù)溫速率約100 ℃/min)，取出椎間盤組織，冰凍切片厚度30 μm。加入5 mg/L的溴化乙錠(ethylene dibromide，EB)和50 mg/L的二醋酸熒光素(fluoresceindiacetate，F(xiàn)DA)各20 μL，加蓋玻片，放入37℃恒溫箱中避光孵育10 min，然后在熒光顯微鏡下觀察軟骨細胞膜的完整性。胞膜完整的髓核細胞將被FDA 染為綠色，胞膜破裂的髓核細胞被EB 染為橙色，計數(shù)每0.01 mm內(nèi)綠染及橙染的細胞數(shù)，髓核細胞存活率為綠染細胞數(shù)/(綠染細胞數(shù)+橙染細胞數(shù))。由于椎間盤組織包括纖維環(huán)及髓核，因此計數(shù)時將纖維環(huán)分為2 部分，即外側(cè)纖維和與髓核相接的內(nèi)層纖維環(huán)，每部分各計數(shù)5 個視野，取均數(shù)，髓核組織亦選取5 個視野計數(shù)。每一計數(shù)結(jié)果需通過肉眼觀察驗證，以盡可能減少由于“過度自動”檢測所致讀數(shù)偏差。另外，同時兼具綠染及橙染的細胞被視為活細胞。

1.3.4 生物力學(xué)測試

測試標本密封冷凍于－30℃冰柜里，測試前12 h置于室溫融解。用特制尖頭螺釘穿透椎間盤上下椎體，將標本固定于MTS 機(MTS 858 Mini BionixⅡ，Eden Prairie)測試夾具上，在動態(tài)運動采集系統(tǒng)軟件的輔助下進行相關(guān)測試。根據(jù)椎間盤本身的生物學(xué)特性，設(shè)計測試不同實驗組標本的機械強度及彈性變形能力并進行比較。首先，軸向位移設(shè)定為1 mm，予以測試標本縱向牽拉力及壓應(yīng)力;然后分別予以標本左/右5°旋轉(zhuǎn)，測試其扭力矩(見圖1)。每一次測試過程中取最大參數(shù)值。為盡可能減少系統(tǒng)誤差，隨機安排予以標本牽拉、壓應(yīng)力測試順序及左/右旋轉(zhuǎn)測試順序，每一標本分別予以3 次完整測試，比較分析不同測試結(jié)果間的差異性，并取其平均值。在測試過程中不斷噴灑0.9%生理鹽水以維持標本的濕度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計分析，方差分析用以驗證不同實驗組變量的差異，各組統(tǒng)計數(shù)據(jù)以±s 表示。為減少個體差異及系統(tǒng)誤差，細胞活性測試結(jié)果以百分比表示。應(yīng)用非參數(shù)檢驗方法，Wilcoxon 秩檢驗用以比較2組間的統(tǒng)計差異，Kruskal-Wallis 檢驗用以2組以上的統(tǒng)計學(xué)比較。成對資料的t 檢驗用以同組間不同時段數(shù)據(jù)的分析比較。統(tǒng)計學(xué)水平取α=0.05。

2 結(jié) 果

熒光顯微鏡下各組椎間盤內(nèi)細胞活性檢測情況見圖2。對照組纖維環(huán)及髓核細胞活性分別為92.6%、90.7%，18 kGy 照射組為76.5%、70.6%，25 kGy照射組為48.9%、50.7%，50 kGy 照射組為18.3%、10.1%(見表1，圖3)。與對照組比較，所有照射組椎間盤纖維環(huán)及髓核的細胞活性均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);同時各處理組間細胞活性亦有明顯差別，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，提示椎間盤接受γ 射線照射劑量與細胞活性水平呈負相關(guān)。

圖1 椎間盤相關(guān)參數(shù)生物力學(xué)測試Fig.1 Biomechanical test analysis for Intervertebral disc

圖2 熒光顯微鏡下觀察椎間盤細胞活性(×200)Fig.2 Disc cell viability detected by fluorescence microscop(×200)

表1 各組椎間盤內(nèi)細胞活性檢測結(jié)果Tab.1 Cell viability in intervertebral disc of different groups

椎間盤施以縱向拉/壓及左/右旋轉(zhuǎn)位移運動后，測試標本未見解剖結(jié)構(gòu)破壞，同一標本多次測試結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示相關(guān)參數(shù)設(shè)置合理。生物力學(xué)實驗顯示γ 射線照射后椎間盤的生物力學(xué)特性未見明顯改變，各組間相應(yīng)受力及扭力矩最大值均無明顯差別，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，相應(yīng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)及分析見表2。

圖3 各實驗組椎間盤細胞活性Fig.3 Cell viability in intervertebral disc treated with various doses of Gamma irradiation

3 討 論

3.1 本研究的意義及特點

作為一種保留手術(shù)節(jié)段活動度的手術(shù)方式，椎間關(guān)節(jié)成形術(shù)避免了由既往融合術(shù)所致鄰近節(jié)段的應(yīng)力集中，從而避免了(至少是減低了)這些節(jié)段椎間盤退變加速的可能［5］。同人工椎間盤置換一樣，異體椎間盤移植旨在重建椎間盤切除術(shù)后的脊柱穩(wěn)定性、恢復(fù)節(jié)段活動度，動物實驗及臨床一期研究均證實了異體椎間盤移植的可行性［1-2］。異體椎間盤在一定程度上模擬正常椎間盤的生物力學(xué)狀態(tài)、動力學(xué)應(yīng)力狀態(tài)及生理功能，具有良好的解剖學(xué)適配性、能夠承受并傳導(dǎo)正常的軸向擠壓及扭轉(zhuǎn)等生物力學(xué)應(yīng)力。

異體組織器官移植的風(fēng)險之一是傳播相關(guān)疾病，如HIV、丙肝及乙肝等，盡管組織移植材料在處理、保存及運輸方面都是嚴格遵守?zé)o菌原則的，但并不能完全消除這些處理過程中移植物被細菌或病毒污染的可能。因此異體組織庫在處理骨肌肉移植材料時，除常規(guī)消毒滅菌處理及無菌操作外還使用(如γ 射線)照射等追加的保險措施，以期獲得更高的安全性［6］。對異體移植物可能傳播HIV 等疾病的顧慮也使γ 射線的應(yīng)用日益普遍，它能夠較理想地覆蓋穿透移植物內(nèi)所有組織結(jié)構(gòu)，同時也是一種相對經(jīng)濟的方法。但是，有報道稱在γ 射線消毒滅菌減少移植物傳播疾病的同時，組織的生物學(xué)性能也可能會受到一定程度的影響［7］。

本研究的特點在于:①評價了經(jīng)γ 射線照射處理后椎間盤的生物學(xué)性能。②成功制作了椎間盤自然支架模型，選擇適宜的γ 射線輻射強度，使得椎間盤去細胞化的同時保留了組織生物力學(xué)性能，初步證實了去細胞化椎間盤作為自然支架應(yīng)用于椎間盤疾病相關(guān)研究的可行性。

3.2 低溫條件下異體椎間盤的保存和γ 射線照射處理過程

椎間盤移植過程中如何保持異體椎間盤細胞活性是一個棘手的問題。低溫保存常被用于保護組織細胞，因為快速的冷凍會增加細胞內(nèi)液的濃度及粘性，從而有助于保存細胞內(nèi)水分、防止細胞快速皺縮［8］。低溫保存前通常在4℃以下的10%的二甲基亞砜溶液中浸泡1～2 h，而后經(jīng)過2 次冷卻處理最終達到－80℃(有條件時再次冷凍保存至－196℃超低溫環(huán)境)。應(yīng)用逐級冷凍技術(shù)，可以使得椎間盤內(nèi)細胞活性保持至24 個月，同時它的機械性能和穩(wěn)定性都沒有發(fā)生明顯變化［9］。

電離輻射對組織及其他生物制劑的損傷機制主要包括直接作用和間接作用。直接作用是離子在遇到組織后發(fā)生共價鍵的斷裂及外層電子的躍遷，從而直接釋放出能量，造成組織的損傷。間接作用是γ 射線作用于水分子、氧氣等產(chǎn)生自由基及活性氧等，作用于靶分子并對其化學(xué)結(jié)構(gòu)造成不可逆損害，其中以O(shè)H-的破壞作用尤為突出;盡管自由基和活性氧只能存在較短的時間，但是它們具有極強的活性，大多數(shù)組織損傷都是由它們所造成的［10］。在低溫環(huán)境下，產(chǎn)生的自由基數(shù)目相對較少，因此對組織造成的損傷也較少。本實驗中，低溫冷凍環(huán)境有利于保護椎間盤內(nèi)的組織細胞，同時優(yōu)化了γ 射線照射環(huán)境、減輕了對組織的損害。

表2 椎間盤體外生物力學(xué)測試結(jié)果Tab.2 Biomechanical test results of intervertebral disc

3.3 γ 射線照射處理椎間盤的細胞活性

椎間盤是由纖維環(huán)、髓核、軟骨終板高度整合構(gòu)成的異質(zhì)體，最終它們作為一個高度整合的整體賦予了椎間盤在機體中獨特的力學(xué)特性和生物學(xué)功能［11］。在尚未退變的椎間盤里，髓核是一個富含水、黏多糖、膠原及非膠原蛋白的有光澤的膠凍狀結(jié)構(gòu);纖維環(huán)是一個有纖維軟骨基質(zhì)構(gòu)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中纖維與脊柱橫截面成角28°～43°;上下軟骨終板對營養(yǎng)物質(zhì)的運輸及代謝廢物的清除起了至關(guān)重要的作用，同時由于軟骨終板的多孔性及可滲透性，它們對液體的散布也起到了一定作用。

纖維環(huán)細胞起源于間充質(zhì)，但是它同時也顯示了一些纖維母細胞及軟骨細胞的特性，例如它可以分泌Ⅰ型、Ⅱ型膠原，合成蛋白多糖。而越靠近內(nèi)側(cè)的纖維環(huán)，纖維環(huán)里的細胞越圓，細胞數(shù)量越少，纖維環(huán)細胞往往被富含Ⅲ型、Ⅳ型膠原的軟骨基質(zhì)所圍繞。在早期的胚胎發(fā)育過程中，椎間盤的環(huán)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)外部分在細胞構(gòu)成和形態(tài)方面有著顯著的不同，環(huán)的外側(cè)是一層層變成長形的細胞構(gòu)成的，而內(nèi)層細胞仍呈圓形的、軟骨樣細胞，沒有形成層狀結(jié)構(gòu)，但是合成了大量的細胞外基質(zhì)。髓核是從脊索分化而來的，在早期胚胎里，脊索來源的髓核細胞聚集在一起，細胞之間有縫隙連接，共同分泌一種半透明的、與成熟椎間盤不一樣的基質(zhì)，最終脊索細胞逐漸被圓形的、包埋在基質(zhì)內(nèi)的軟骨樣細胞所代替。

細胞活性水平取決于存活細胞和死亡細胞間的比例。研究顯示，γ 射線對組織的損傷程度與照射劑量及照射時組織的物理狀態(tài)有關(guān)。新鮮冷凍保存椎間盤后，纖維環(huán)及髓核內(nèi)仍能保證有＞90%的細胞存活［9］。但經(jīng)γ 射線照射后，存活細胞比例迅速減小，其中接受高劑量照射的椎間盤內(nèi)存活細胞數(shù)量明顯小于接受低劑量照射組。低劑量γ 射線照射的椎間盤內(nèi)保留了較多存活的細胞，故而期望該組椎間盤移植后能夠更好地承擔(dān)生物學(xué)功能。盡管之前針對異體骨的實驗建議首選中等照射劑量［12］，但是很難確定具有較低細胞活性的椎間盤能否承擔(dān)理想的生物學(xué)功能，而接受高劑量照射的椎間盤可能更加難以完成最基本的生物學(xué)活動。

3.4 γ 射線照射對椎間盤機械性能的影響

對骨骼肌肉移植材料的消毒滅菌處理仍是一個極大的挑戰(zhàn)，γ 射線應(yīng)該能夠穿透整個移植材料，在殺滅可能攜帶的病原微生物的同時，盡量保持異體組織生物學(xué)及機械性能。與椎間盤相類似，一些學(xué)者研究了γ 射線對肌腱、骨以及骨-肌腱-骨復(fù)合體生物力學(xué)特性的影響?？傮w來說，20 kGy 的放射劑量對所有類型的異體移植物都是安全可行的，對組織的機械性能不會產(chǎn)生嚴重的損傷。對醫(yī)用材料來講，通常＜20 kGy 的照射劑量就足以達到滅菌消毒目的，在20 kGy γ 射線作用下，大多數(shù)對射線敏感的細菌病毒(包括HIV 病毒)都能夠被殺滅［13］。但為保險起見，國際原子能機構(gòu)(international atomic energy agency，IAEA)推薦25 kGy 作為醫(yī)用材料消毒滅菌的標準劑量，而大多數(shù)商業(yè)性異體組織庫建議使用15～20 kGy 的照射劑量進行消毒滅菌。Vangsness 等［14］對36 家組織庫的一項調(diào)查顯示，大多組織庫選擇10～35 kGy 不等的γ 射線劑量。Fideler等［15］針對骨肌腱移植材料的研究顯示，往往需要40 kGy 的照射強度才可能殺滅HIV、甲肝、丙肝及其他病毒微生物。而Grieb 等［16］建議的照射劑量高達50 kGy，單位面積內(nèi)可以殺滅16 log10 耐藥微生物、＞4.5 log10 辛德比斯病毒及4.9 log10 細小病毒。

選擇合適的異體椎間盤應(yīng)考慮到其初始的機械性能和植入后對應(yīng)力的承受能力。本實驗顯示，各處理組與對照組椎間盤的生物力學(xué)特性是一致的，這是進行椎間盤體內(nèi)移植的先決條件。經(jīng)γ 射線處理的椎間盤能夠較好地保持原有的機械性能及生物學(xué)特性，這無疑將為異體椎間盤提供一個全新的消毒滅菌方法。本研究通過體外實驗評估了經(jīng)γ射線處理的椎間盤的生物力學(xué)特性的變化，研究顯示椎間盤在高達50 kGy 劑量(接近于常規(guī)劑量的3倍)照射后仍展現(xiàn)了良好的生物力學(xué)性能，在采取優(yōu)化照射措施的前提下，達到消毒滅菌效果的同時對組織的傷害程度相對較小。

3.5 展望

目前，國內(nèi)外很多學(xué)者都在試圖找到一種修復(fù)退變性椎間盤的方法，提出了諸如基因治療、生長因子注射、以細胞為基礎(chǔ)的組織工程及細胞治療等多種療法?？紤]到包括蛋白多糖及膠原等基質(zhì)的減少為椎間盤退變的主要始動因素，研究人員通過植入能夠產(chǎn)生基質(zhì)的細胞來修復(fù)退變性椎間盤，即所謂的細胞治療方法［17］。目前應(yīng)用的細胞主要包括脊索髓核細胞、自體椎間盤軟骨細胞、彈性軟骨或肋軟骨以及間充質(zhì)干細胞等，實驗結(jié)果令人振奮，從中看到了可以延緩椎間盤退行性變甚至重塑椎間盤組織的可能性。但是，還有一些問題亟待解決，包括如何建立可靠的椎間盤移植動物模型、細胞植入的最佳干預(yù)時機等。

適當(dāng)劑量的γ 射線照射處理椎間盤，其內(nèi)細胞活性仍可保持在一定的水平，同時無明顯生物力學(xué)等機械性能的降低，提示經(jīng)照射處理的異體椎間盤有可能作為自然支架為纖維環(huán)及髓核細胞的增殖提供理想的生理環(huán)境。但是，除了自由基的直接損害作用外，γ 射線還可造成對遺傳物質(zhì)核糖核酸的損傷，導(dǎo)致相關(guān)基因組的損傷及功能障礙，進而影響到體內(nèi)實驗中活性細胞的作用表達。因此，經(jīng)γ 射線照射后異體椎間盤應(yīng)用的確切效果有待體內(nèi)動物實驗進一步明確。一方面需要觀察不同劑量照射處理的椎間盤移植后的生物學(xué)轉(zhuǎn)歸，即能否維持椎間盤高度及穩(wěn)定性、能否保持手術(shù)節(jié)段的功能及活動度;另一方面需要進一步探討自然椎間盤支架在椎間盤疾病相關(guān)研究中的實際應(yīng)用價值，如去細胞化椎間盤能否為特定細胞提供理想的生存增殖環(huán)境。

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