杜 靜，楊 超，晏耀明，陸 紅，周 薇，鄒德學(xué)

（1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳518036；2.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳518020）

肥胖已成為現(xiàn)代生活的流行病和21世紀(jì)影響人類(lèi)健康的主要危險(xiǎn)因素之一，深入了解機(jī)體甘油三酯合成和動(dòng)員的調(diào)控機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)治療肥胖的新方法。有研究表明一種脂肪特異性AMPK相關(guān)蛋白激酶－SIK2，在脂肪細(xì)胞的能量代謝中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［1］。本試驗(yàn)通過(guò)前期構(gòu)建好的SIK2腺病毒表達(dá)載體，研究SIK2基因高表達(dá)影響3T3－L1成熟脂肪細(xì)胞能量代謝的作用及其機(jī)制，深入認(rèn)識(shí)脂代謝異常的發(fā)病機(jī)理，為發(fā)現(xiàn)治療肥胖新的分子靶標(biāo)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 3T3－L1細(xì)胞系購(gòu)自 ATCC公司。SIK2腺病毒表達(dá)載體由我室構(gòu)建和鑒定［2］，胰蛋白酶購(gòu)自GIBCO公司。M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（molony murine leukemia virus reverse transcriptase）購(gòu)自Promega公司。DMEM和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司。SIK2、ACC2、FAS、SCD1、GPAT、DGAT1、SREBP1和三磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde－3－Phosphate Dehydrogenase ，GAPDH）。PCR 引物由上海生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 3T3－L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化：3T3－L1細(xì)胞按常規(guī)的貼壁細(xì)胞方法培養(yǎng)。在細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，傳代分瓶（1×105／ml），細(xì)胞接觸抑制兩天后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（含0.5 m M 3－異丁基－1甲基黃呤、10μg／ml胰島素、0.25μM地塞米松）培養(yǎng)兩天，換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（含10μg／ml胰島素）培養(yǎng)兩天，最后改為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q液，直至90%的細(xì)胞為成熟的脂肪細(xì)胞。

1.2.2 SIK2腺病毒載體轉(zhuǎn)染成熟的3T3－L1：脂肪細(xì)胞用2.5×1011純化病毒顆粒／ml SIK2腺病毒和空載體病毒轉(zhuǎn)染成熟3T3－L1脂肪細(xì)胞，并以空載體病毒作為陰性對(duì)照，更換培養(yǎng)液后在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。

1.2.3 油紅O染色：各組3T3－L1前脂肪細(xì)胞傳代于放置無(wú)菌玻片的6孔板中，細(xì)胞按上述誘導(dǎo)分化方案進(jìn)行誘導(dǎo)，分別于轉(zhuǎn)染的48小時(shí)后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色。按Ramirez等報(bào)道的油紅O染色提取法提取結(jié)合到脂滴的油紅O染料［3］，即0.5%油紅O貯存液（溶于異丙醇）用水按3∶2稀釋。棄去培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，PBS沖洗3次；用3.7%中性福爾馬林固定5 min，PBS洗滌3次；固定后的細(xì)胞用上述油紅O稀釋液室溫孵育1 h后，移去染液，蒸餾水漂洗細(xì)胞3次倒置顯微鏡下觀察。用水徹底沖洗后干燥，入異丙醇提取結(jié)合到脂滴的染料，在510 nm波長(zhǎng)處比色，記錄吸光度。

1.2.4 實(shí)時(shí)RT－PCR檢測(cè)脂肪細(xì)胞中SIK2和脂代謝相關(guān)酶及轉(zhuǎn)錄因子SREBP1的表達(dá)：收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的成熟脂肪細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。實(shí)時(shí)RT－PCR按SYBR Prime－Script RT－PCR kit的操作說(shuō)明進(jìn)行，擴(kuò)增采用ABI PRISM 7900 Sequence Detectort（美國(guó)ABI公司）熒光定量PCR儀，測(cè)定SIK2和脂代謝相關(guān)酶及轉(zhuǎn)錄因子SREBP1 m RNA表達(dá)，結(jié)果以目標(biāo)基因與GAPDH基因表達(dá)的比值表示，相應(yīng)引物的序列見(jiàn)表1。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析：用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）來(lái)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 SIK2基因高表達(dá)對(duì)3T3－L1脂肪細(xì)胞脂滴形成的影響 顯微鏡下觀察，未分化脂肪細(xì)胞為梭型或三角形，類(lèi)似于成纖維細(xì)胞，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)，細(xì)胞分化充脂，隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸聚集為大脂滴。腺病毒載體轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞，用油紅O染色提取法測(cè)定波長(zhǎng)510 nm處結(jié)合于脂滴的油紅O染料的吸光度，以平均值±SD表示。由圖1可見(jiàn)，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，與對(duì)照組比較，SIK2基因高表達(dá)組細(xì)胞漿中脂滴數(shù)量和體積均明顯減少，脂肪細(xì)胞內(nèi)油紅O染料的吸光度下降56%，由0.63降低到0.28（P＜0.05）。

表1 單鏈oligo引物設(shè)計(jì)

2.2 SIK2基因高表達(dá)對(duì)脂肪細(xì)胞生脂基因及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響 實(shí)時(shí)熒光RT－PCR定量測(cè)定脂肪細(xì)胞SIK2和脂肪合成有關(guān)基因mRNA水平，結(jié)果以目標(biāo)基因與GAPDH基因表達(dá)的比值表示，見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示SIK2腺病毒載體轉(zhuǎn)染組SIK2 mR NA水平與空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照組脂肪細(xì)胞比較，表達(dá)量明顯增加，達(dá)到273倍（圖A），證實(shí)脂肪細(xì)胞高效表達(dá)腺病毒載體轉(zhuǎn)染的SIK2基因。在SIK2基因轉(zhuǎn)染組，脂肪細(xì)胞脂合成代謝相關(guān)基因ACC2、FAS、SCD1、GPAT、DGAT1的 mRNA水平與對(duì)照組相比分別下降了31%、61%、57%、60%、52%，轉(zhuǎn)錄因子SREBP1 mRNA的表達(dá)水平減少了28%（P＜0.05）（圖B）。

圖1 SIK2基因高表達(dá)對(duì)脂肪細(xì)胞脂肪合成的作用影響

圖2 SIK2基因高表達(dá)影響脂肪細(xì)胞脂代謝有關(guān)基因的表達(dá)

3 討論

肥胖的主要原因是機(jī)體能量代謝失衡，熱量攝入大于消耗而導(dǎo)致機(jī)體脂肪的過(guò)量沉積。控制肥胖，減少體脂聚集可降低心血管疾病的危險(xiǎn)性和發(fā)病率。SIK2是新發(fā)現(xiàn)的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）族系的一個(gè)成員，SIK2蛋白分子較特異地表達(dá)于脂肪組織中。有研究表明SIK2是調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝過(guò)程中的一個(gè)重要能量調(diào)控蛋白［1］，但具體機(jī)制尚不清楚。

利用我們構(gòu)建高效表達(dá)SIK2的重組小鼠腺病毒載體［2］，通 過(guò) R－T PCR 和 Western Blot證 實(shí)3T3－L1脂肪細(xì)胞高效表達(dá)SIK2 m RNA和蛋白，但SIK2對(duì)脂肪細(xì)胞功能的影響尚不十分清楚。3T3－L1未分化脂肪細(xì)胞是從小鼠Swiss 3T3纖維母細(xì)胞克隆出來(lái)的，在誘導(dǎo)劑（insulin、IBMX和DEX）作用下，分化為成熟的脂肪細(xì)胞［4］，通過(guò)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，用小鼠SIK2重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染3T3－L1成熟脂肪細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)SIK2基因的脂肪細(xì)胞株，觀察SIK2基因高表達(dá)對(duì)脂肪細(xì)胞脂肪合成的影響。

在脂肪酸生物合成中，ACC、FAS、SCD－1是脂肪酸合成限速酶。ACC催化脂肪酸合成的第一步反應(yīng)，即乙酰Co A羧化為脂肪酸合成必需的底物丙二酰Co A（MA），然后MA在脂肪酸碳鏈延長(zhǎng)酶系作用下進(jìn)一步合成長(zhǎng)鏈脂肪酸。最近研究表明，ACC受磷酸化、去磷酸化的調(diào)節(jié)，AMPK是調(diào)節(jié)ACC活性的主要物質(zhì)，使ACC磷酸化和抑制ACC的作用［3］。FAS是脂肪酸合成最后環(huán)節(jié)的限速酶，催化MA和乙酰Co A合成棕櫚酸，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性脂肪酸的合成。FAS的表達(dá)主要在轉(zhuǎn)錄水平被調(diào)控，動(dòng)物體脂水平與FAS的表達(dá)呈正相關(guān)［6］。SCD－1是催化單不飽和脂肪酸合成的限速酶，GPAT和DGAT分別是催化甘油－3－磷酸酯合成甘油三酯的初始和最后步驟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SIK2高表達(dá)顯著降低3T3－L1脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪含量，提示SIK2可抑制3T3－L1細(xì)胞的脂肪合成功能，其作用與下調(diào)脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成關(guān)鍵酶 ACC、FAS、SCD－1、GPAT 和 DGAT1 mRNA的表達(dá)有關(guān)。該結(jié)果說(shuō)明了SIK2作為AMPK家族中的成員，起到了AMPK樣的降低ACC活性的作用，同Saha AK報(bào)道的一致［5］。

轉(zhuǎn)錄因子SREBPs是一類(lèi)能與膽固醇調(diào)節(jié)組件1（SRE－1）發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白，包括兩種異構(gòu)體SREBP－1和SREBP－2。SREBP－1可調(diào)控脂肪酸和甘油三酯的合成，SREBP－2主要調(diào)控膽固醇代謝。SREBP－1在脂肪酸合成中所調(diào)控的靶基因有：ACC、FAS、SCD、GPAT 等［7］，其中 FAS基因是脂肪酸合成中的關(guān)鍵酶。Kakuma等的研究發(fā)現(xiàn)SREBP－1c的過(guò)度表達(dá)可引起FAS基因轉(zhuǎn)錄增加，從而導(dǎo)致FAS活性的增強(qiáng)，并引起脂肪酸合成增多和TG增加，在肝臟等非脂肪組織異常沉積形成脂肪肝［8］。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) SIK2轉(zhuǎn)染組 SREBP－1 m RNA的表達(dá)水平相應(yīng)地降低，提示SIK2抑制脂肪合成代謝的作用與SREBP－1信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)，SIK2可能通過(guò)降低SREBP－1水平來(lái)調(diào)節(jié)ACC、FAS、SCD、GPAT、DGAT等脂肪合成基因的表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)脂肪含量。

綜合所述，本研究從基因水平探討了SIK2對(duì)脂肪細(xì)胞能量代謝的影響和機(jī)制，其在蛋白水平的作用有待進(jìn)一步證實(shí)。深入研究SIK2這一新的脂代謝調(diào)節(jié)因子將為探索肥胖病基因治療的新途徑提供理論依據(jù)，為尋找新的防治肥胖的藥物作用靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)資料。

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