陳 焰 ，陳新峰 ，闕萬才 ，楊 菁

(1.福建省福清市第一醫(yī)院藥劑科，福建 福州 350300;2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院藥學(xué)部，福建 福州 350001)

金線蓮主要分布在我國(guó)亞熱帶地區(qū)，其中以閩、浙、贛、臺(tái)為主要產(chǎn)地，特別在臺(tái)灣地區(qū)備受青睞，被稱為“藥中之王”[1]。目前，我國(guó)對(duì)該植物的研究主要集中在人工栽培、組培、藥理等方面，而對(duì)其有效成分抗腫瘤作用的研究報(bào)道較少，限制了開發(fā)利用。本試驗(yàn)中，應(yīng)用水蒸氣蒸餾提取法對(duì)金線蓮中的揮發(fā)油成分進(jìn)行提取分析，并研究其體外抗腫瘤活性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(6890N網(wǎng)絡(luò)氣相色譜體系構(gòu)建)，5975B InertxlMSD，進(jìn)樣系統(tǒng)為7683B系列，均來自美國(guó)安捷倫公司;LC-2010C型高效液相色譜儀(日本島津);酶標(biāo)儀450(美國(guó)Bio-Rad公司)。福建組培金線蓮鮮草(購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院中藥房);四甲基偶氮唑鹽(MTT，西格瑪公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(胎牛血清，批號(hào)為NVL0338);人肺癌細(xì)胞NCI-H446細(xì)胞，由福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液學(xué)研究所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 水蒸汽蒸餾法提取金線蓮揮發(fā)油

將新鮮的金線蓮用剪刀剪成約0.5 cm長(zhǎng)的小段，精密稱取50 g，加適量水溶解，浸泡 24 h，用揮發(fā)油提取器提取 15 h，得到黃色的揮發(fā)油30 mg，加乙醚溶解并定容到2 mL容量瓶。揮發(fā)油提取率為0.06%。

2.2 色譜條件[2]

氣相色譜:色譜柱為DB-35MS石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25μm);載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min;分流進(jìn)樣比為5∶1;進(jìn)樣量為1μL;升溫程序?yàn)?5℃保持7 min，以6℃ /min升溫到120℃(保持2min)，再以3℃ /min升溫到280℃，共計(jì)74min;進(jìn)樣口溫度為250℃。

質(zhì)譜:離子源為EI源;電子轟擊電壓70eV;離子源溫度為230℃;四極桿溫度為 150℃;傳輔線溫度為280℃;溶劑延遲4.0 min;質(zhì)量掃描方式為全掃描(SCAN);掃描范圍1.6～500 amu;NIST107標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜檢索庫(kù)。

2.3 樣品測(cè)定

取備用樣品兩份，在上述氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)條件下，對(duì)水蒸氣蒸餾法提取金線蓮揮發(fā)油進(jìn)行分析，得總離子流色譜圖(圖1)，檢出78個(gè)色譜峰。采用計(jì)算機(jī)對(duì)各峰質(zhì)譜圖進(jìn)行NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)檢索和根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行核對(duì)，鑒定了37個(gè)化合物，以十六羧酸甲酯、棕櫚酸為主，其次為亞油酸、亞麻酸甲酯和2-十二酮，其他成分多為飽和烷烴、脂肪酸、脂肪酸酯、醛、酮及酚。采用歸一化法計(jì)算各化合物的含量，占揮發(fā)油總量的96.26%。結(jié)果見圖1、圖2和表1。

圖1 金線蓮揮發(fā)油成分總離子流圖

圖2 金線蓮揮發(fā)油中十六羧酸甲酯質(zhì)譜圖

2.4 人肺癌細(xì)胞NCI－H446細(xì)胞增殖能力影響試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌細(xì)胞NCI-H446，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL。試驗(yàn)組加入不同質(zhì)量濃度的金線蓮揮發(fā)油，使終質(zhì)量濃度為 10，20，40，80，160，320 μg/mL。對(duì)照組加入等體積(含0.5%二甲基亞砜)培養(yǎng)液，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃培養(yǎng)24 h或48 h后。每孔加入20μL MTT(5 g/L，pH為7.4的磷酸緩沖液配制)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。離心，棄上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜，微量振蕩儀振蕩10 min，立即用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。計(jì)算抑制率和半數(shù)細(xì)胞抑制率(IC50):抑制率=1-(試驗(yàn)組 OD值/對(duì)照組 OD值)×100%。以同一藥物的不同質(zhì)量濃度對(duì)抑制率作圖，可得劑量反應(yīng)曲線。根據(jù)線性回歸方程求出該藥物的 IC50，即細(xì)胞存活率減少50%時(shí)的藥物濃度。試驗(yàn)重復(fù)3次[3]，結(jié)果見圖3?？梢姡鹁€蓮揮發(fā)油對(duì)人肺癌細(xì)胞NCIH446的抑制作用隨著時(shí)間和濃度的增加而升高。24 h和48 h時(shí)金線蓮揮發(fā)油對(duì)NCI-H446細(xì)胞的 IC50分別為70.17和122.85μg/mL。

表1 金線蓮中揮發(fā)油成分百分含量

圖3 金線蓮提取物對(duì)NCI-H446細(xì)胞的抑制作用

3 討論

采用水蒸氣蒸餾法提取福建組培金線蓮的揮發(fā)油成分中，以十六羧酸甲酯(47.98%)、棕櫚酸(20.57%)為主，其次為亞油酸(6.17%)、亞麻酸甲酯(4.07%)和2-十二酮(3.73%)。從海南栽培金線蓮中提取揮發(fā)油的主要成分為正十六烷酸、(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸、(Z，Z，Z)-9，12，15-十八碳三烯酸甲酯和(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸甲酯[4]。而從福建省漳州市金線蓮中提取揮發(fā)油的主要成分為十八烷酸和正十六烷酸[5]。尚未見從臺(tái)灣金線蓮揮發(fā)油中檢出十六酸甲酯與大量的烷烴類化合物的相關(guān)文獻(xiàn)。這提示不同地區(qū)的栽培金線蓮所含揮發(fā)性成分差異較大。因此，研究不同地區(qū)金線蓮揮發(fā)油中的主要成分，對(duì)于開發(fā)具有地方特色的中草藥意義重大。

將由福建組培金線蓮中提取的揮發(fā)油作用于人肺癌細(xì)胞NCI-H446 24 h或48 h以后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果表明，金線蓮揮發(fā)油對(duì)人肺癌細(xì)胞NCI-H446有抑制作用，且抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性。

本試驗(yàn)表明，金線蓮中的揮發(fā)油成分具有一定的抗肺腫瘤作用，是非常有前景的抗腫瘤藥物或輔助抗腫瘤藥物。筆者將進(jìn)一步探討金線蓮揮發(fā)油抑制人肺癌細(xì)胞NCI-H446增殖的作用。

[1]孔祥海.“藥王”金線蓮的自然資源初步研究[J].中草藥，2001，32(2):155-157.

[3]曾慶華，呂新生，湯輝煥.MTT測(cè)定惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[J].中國(guó)普通外科雜志，2000，9(6):552-554.

[4]韓美華，楊秀偉，靳彥平.金線蓮揮發(fā)油化學(xué)成分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18(1):65-68.

[5]蔡金艷，張勇慧，吳繼洲.藥王金線蓮揮發(fā)油及石油醚提取物的氣相色譜-質(zhì)譜-數(shù)據(jù)系統(tǒng)聯(lián)用測(cè)定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(7):1 550-1 552.