費曉紅， 葉紅華△， 阮列敏， 楊 璐， 樓燕如， 張宜生， 沈旭平

(寧波市第一醫(yī)院1心血管內(nèi)科，2精神衛(wèi)生科，3中心實驗室，4婦產(chǎn)科，浙江 寧波 315010)

1000-4718(2012)03-0393-05

2011-10-06

2011-12-21

寧波市醫(yī)學科技計劃項目(No.2009A04)

△通迅作者 Tel: 0574-87085220; E-mail: yehonghua@medmail.com.cn

成人循環(huán)內(nèi)皮祖細胞的性別差異和雌二醇的體外動員作用*

費曉紅1， 葉紅華1△， 阮列敏2， 楊 璐2， 樓燕如3， 張宜生4， 沈旭平1

(寧波市第一醫(yī)院1心血管內(nèi)科，2精神衛(wèi)生科，3中心實驗室，4婦產(chǎn)科，浙江 寧波 315010)

目的探討成人循環(huán)內(nèi)皮祖細胞(EPCs)數(shù)量及功能的性別差異、女性月經(jīng)周期對其的影響和雌二醇的體外動員作用。方法選擇月經(jīng)周期正常的健康女性和年齡匹配的同等條件男性各10名，男性1次采血，女性在月經(jīng)周期內(nèi)3個性激素變化階段(卵泡初期、排卵前期和黃體中期)分別采血。用流式細胞儀計數(shù)循環(huán)CD34+/CD133+/含有激酶插入結構域的受體(KDR)+的EPCs數(shù)量，放射免疫法測定雌二醇水平；經(jīng)體外培養(yǎng)7 d，計數(shù)EPCs，并觀察其黏附能力；分別通過跨膜遷移實驗和增殖實驗觀察不同濃度雌二醇的影響。結果女性組循環(huán)EPCs數(shù)量明顯高于男性組(P<0.01)，月經(jīng)周期內(nèi)排卵前期和黃體中期明顯高于卵泡初期(P<0.05)。經(jīng)體外培養(yǎng)測定EPCs功能，男性與女性無明顯差異。較高濃度的雌二醇(≥1×10-9mol/L)能顯著增強EPCs的跨膜遷移能力和增殖能力(P<0.05)。結論成人循環(huán)EPCs數(shù)量存在性別差異并且受女性月經(jīng)周期影響，雌二醇對EPCs的動員有重要作用。

內(nèi)皮祖細胞； 雌二醇； 性別差異； 月經(jīng)周期

干細胞或祖細胞的研究是目前生命科學研究中最具活力的研究領域之一。在諸多的干細胞研究中，內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)的研究正越來越多地受到人們的關注，尤其是外周血中的EPCs。EPCs是一類具有增殖分化能力并可分化為內(nèi)皮細胞的前體細胞，參與損傷血管的再生和修復。近年來，EPCs在心腦血管疾病、腫瘤血管形成和創(chuàng)傷愈合等血管類疾病的治療中展現(xiàn)出廣泛的應用前景。流行病學資料顯示育齡期女性和年齡相仿的男性相比動脈粥樣硬化性心血管疾病的風險降低，證實了雌激素具有多種機制的心血管保護作用，其中之一可能通過EPCs實現(xiàn)[1]，故雌激素和動脈粥樣硬化性心血管疾病的研究轉向新的可能機制和途徑。

EPCs的性別差異近年來正在成為動脈粥樣硬化性疾病性別差異的一個研究焦點。目前對健康成人循環(huán)EPCs數(shù)量的研究甚少，循環(huán)EPCs的性別差異尚不確定，女性月經(jīng)周期對EPCs影響尚不確定。所以本研究從性別和女性月經(jīng)周期不同階段這兩個方面切入，研究循環(huán)EPCs數(shù)量和功能的性別差異, 以及與雌激素的可能關系。

材 料 和 方 法

1標本來源

選擇無高血壓、糖尿病，不吸煙，無肥胖，無早發(fā)心血管疾病家族史，月經(jīng)周期正常的育齡期健康女性和年齡匹配的同等條件男性各10名。女性在月經(jīng)周期的卵泡初期(menstrual，M)、排卵前期(pre-ovulatory，PO)和黃體中期(mid-luteal，ML)分別抽取外周血25 mL；男性一次性抽取外周血25 mL。

2材料與試劑

CD133- PE購自eBioscience；CD34-ECD購自Coulter；含有激酶插入結構域的受體(kinase insert domain-containing receptor,KDR)- FITC購自BD；胎牛血清購自Gibco；EGM-2培養(yǎng)基購自Lonza；EGM2-MV Bullet Kit(CC-3202)購自Clonetic；人淋巴細胞分離液(Ficoll分離液)購自天津灝洋公司；DiI-acLDL購自Molecular Probe；人纖維連接蛋白、雌二醇、胰蛋白酶、FITC-UEA-I購自Sigma；MTT試劑盒購自Trevigen；MatrigelTMBasement Membrane Matrix購自Becton Dickison；Coster Transwell購自Corning。

3方法

3.1血標本收集 清晨空腹抽取外周血25 mL，分裝2個試管，1管3 mL送性激素水平測定，另1管22 mL加肝素抗凝送循環(huán)EPCs計數(shù)和EPCs的分離、培養(yǎng)。

3.2性激素水平的測定 放射免疫法測定雌二醇水平。

3.3循環(huán)EPCs計數(shù) 取2 mL外周抗凝血，用流式細胞儀計數(shù)外周血中標記為CD34+/CD133+/KDR+的EPCs。

3.4循環(huán)EPCs分離、培養(yǎng) 20 mL外周抗凝血，與Hanks’液1∶1混勻，以4∶3比例小心加于Ficoll分離液上，2 000 r/min離心30 min，吸取單個核細胞層，用3倍體積的Hanks’液洗滌2次，每次都以1 500 r/min離心10 min，末次離心后棄去上清液，加入EGM-2培養(yǎng)液混懸，調(diào)整濃度為3×109/L，取2 mL接種于包被人纖維連接蛋白(1 mg/L)的6孔培養(yǎng)板中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，48 h后換液，洗去非貼壁細胞，以后隔天換液繼續(xù)培養(yǎng)至7 d。

3.5EPCs的鑒定 免疫熒光細胞化學染色法鑒定EPCs。培養(yǎng)7 d的貼壁細胞，更換含10 mg/L DiI-acLDL的培養(yǎng)液，37 ℃孵育4 h，PBS清洗后用4%多聚甲醛固定10 min，PBS浸洗2次，加入含10 mg/L FITC-UEA-I的培養(yǎng)液，37 ℃孵育1 h，PBS浸洗后在激光共聚焦顯微鏡下觀察DiI-acLDL、FITC-UEA-I雙熒光染色陽性即為EPCs。培養(yǎng)7 d的細胞，相差顯微鏡下對EPCs進行記數(shù)(隨機選取10個200倍視野)。

3.6黏附能力 EPCs培養(yǎng)7 d后用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞，懸浮于1 mL培養(yǎng)液中計數(shù)，然后將同等數(shù)量的EPCs接種于包被人纖維連接蛋白的6孔培養(yǎng)板，37 ℃培養(yǎng)30 min，計數(shù)10個隨機200倍視野中的貼壁細胞。

3.7雌二醇的體外動員作用 選取培養(yǎng)7 d的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞，分別通過跨膜遷移實驗和增殖實驗觀察雌二醇對EPCs的影響。

3.7.1跨膜遷移能力檢測 用50 mg/L Matrigel包被Transwell小室底部，37 ℃風干備用。將Transwell小室放在24孔培養(yǎng)板中，然后將100 μL、1×109/L細胞懸液接種于Coster Transwell(膜直徑6.5 mm，孔徑8 μm)的上層，下層加入600 μL的培養(yǎng)液，并分別在培養(yǎng)液中加入雌二醇(終濃度分別為1×10-10、1×10-9、1×10-8mol/L)，在37 ℃、5%CO2條件下孵育24 h。拭去上室濾膜面的未遷移細胞，保留定向遷移至濾膜下表面的細胞，4%多聚甲醛固定30 min，Giemsa染色，每片膜計數(shù)5個隨機200倍視野中的遷移細胞。以加入PBS代替雌二醇作為對照組。

3.7.2增殖能力檢測 MTT比色實驗。取1 mL、 2×107/L細胞懸液接種于包被人纖維連接蛋白的96孔培養(yǎng)板中，加入雌二醇(濃度為1×10-10、1×10-9、1×10-8mol/L)，在37 ℃、5%CO2條件下孵育24 h。每孔加MTT溶液(5 g/L)20 μL，混勻后繼續(xù)孵育4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min，在自動酶聯(lián)檢測儀上選擇490 nm波長測定各孔的吸光度(A)值。以加入PBS代替雌二醇作為對照組。

4統(tǒng)計學處理

結 果

1循環(huán)EPCs數(shù)量和雌二醇水平

女性組在月經(jīng)周期內(nèi)3個不同階段(卵泡初期、排卵前期、黃體中期)循環(huán)EPCs數(shù)量均明顯高于男性組(P<0.01)，提示EPCs的性別差異。在這3個階段中，排卵前期、黃體中期循環(huán)EPCs的數(shù)量要明顯高于卵泡初期(P<0.05)。同步測定外周血雌二醇水平，男性組低于女性組平均水平，女性組在排卵前期、黃體中期明顯高于卵泡初期(P<0.01)，和循環(huán)EPCs數(shù)量變化一致。所以女性循環(huán)EPCs數(shù)量受月經(jīng)周期影響，并與雌二醇水平呈正相關(r=0.428,P<0.05),見圖1、表1。

Figure 1. Flow cytometric analyses of EPCs. B: cells displayed the CD34+phenotype. Quadrant D2: cells displayed the CD34+/CD133+/KDR+phenotype.

圖1流式細胞術分析圖

表1成人循環(huán)EPCs數(shù)量、雌二醇水平

GroupAge(year)BMI(kg/m2)EPCs(×103/L)Estradiol(ng/L)Men23.4±1.120.8±1.6226±6542.5±5.8Women-M23.3±0.920.3±1.3510±166**37.6±12.4Women-PO23.3±0.920.3±1.3727±133**##246.6±90.0##Women-ML23.3±0.920.3±1.3638±163**#191.3±91.8##

**P<0.01vsmen group;#P<0.05,##P<0.01vswomen-M group. M: menstrual; PO: pre-ovulatory; ML: mid-luteal; BMI: body mass index.

2EPCs的鑒定、計數(shù)和黏附能力的測定

分離獲得的單個核細胞培養(yǎng)7 d后呈梭型,見圖2，用激光共聚焦顯微鏡鑒定，DiI-acLDL染色呈紅色熒光，F(xiàn)ITC-UEA-I染色呈綠色熒光，雙熒光染色陽性的細胞呈黃色，被認為是正在分化的EPCs，見圖3。經(jīng)體外培養(yǎng)7 d后，細胞數(shù)量(cells/×200視野)男性組為61.5±12.3，女性組在卵泡初期、排卵前期、黃體中期分別為61.4±10.7、64.5±10.5、63.9±10.9；黏附能力(cells/×200視野)男性組為25.9±5.6，女性組分別為25.0±4.1、21.6±4.0、23.6±2.9。組間無明顯差異。

Figure 2. The mononuclear cells culturedinvitrofor 7 d (phase contrast microscopy, ×200).

圖2單個核細胞體外培養(yǎng)7d后細胞形態(tài)

3雌二醇的體外動員作用

不論是男性組還是女性組，EPCs的跨膜遷移能力和增殖能力與雌二醇濃度呈正相關(r=0.779,P<0.01;r=0.585,P<0.01)，當雌二醇濃度≥1×10-9mol/L時,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但男女2組之間及月經(jīng)周期內(nèi)不同階段之間無明顯差異,見表2、3)。所以雌激素能增強EPCs的跨膜遷移能力和增殖能力，但這種體外動員作用不存在性別差異。

Figure 3. Immunocytochemical fluorescence staining showing EPCs culturedinvitrofor 7 d (confocal laser scanning microscopy, ×400). A: EPCs containing DiI-acLDL express red signals; B: EPCs containing FITC-UEA-I express green signals; C: EPCs containing DiI-acLDL and FITC-UEA-I express orange signals.

圖3體外培養(yǎng)7d后免疫熒光細胞化學染色鑒定EPCs

表2雌二醇對EPCs跨膜遷移能力的影響

GroupControlConcentrationofestradiol(mol/L)1×10-101×10-91×10-8Men262.5±45.4298.8±51.9353.7±31.8**408.2±30.4**Women-M269.6±38.4307.9±47.7335.2±35.1**405.9±42.4**Women-PO288.1±39.9320.6±21.7336.8±47.1*381.1±27.5**Women-ML287.5±35.4323.4±32.6376.4±40.7**408.3±33.0**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group. M: menstrual; PO: pre-ovulatory; ML: mid-luteal.

表3雌二醇對EPCs增殖能力的影響

GroupControlConcentrationofestradiol(mol/L)1×10-101×10-91×10-8Men0.508±0.0770.563±0.0620.601±0.050**0.630±0.045**Women-M0.539±0.0440.589±0.0520.628±0.042**0.642±0.063**Women-PO0.556±0.0400.582±0.0510.621±0.064*0.654±0.044**Women-ML0.546±0.0540.588±0.0520.617±0.059*0.632±0.052**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group. M: menstrual; PO: pre-ovulatory; ML: mid-luteal.

討 論

1997年Asahara等首次提出了具有血管新生作用的EPCs，自此有關EPCs的研究成為熱點。EPCs是發(fā)源于中胚層的一群發(fā)源部位緊鄰、并具有發(fā)育和分化為外周血管內(nèi)皮細胞功能的細胞群。根據(jù)目前的研究，EPCs主要來源于外周血、骨髓、髓外單核系(CD14陽性)細胞、組織干細胞，這些不同來源的EPCs組成了一個有很強異質(zhì)性的細胞群，具有啟動新血管形成的潛能和靶向修復受損血管的能力。

EPCs自從被發(fā)現(xiàn)以來，一直沒找到特異的標記。最初EPCs被標記為既表達造血干細胞的表面抗原如CD34,又表達內(nèi)皮系的表面抗原如KDR。但是CD34在成熟血管內(nèi)皮細胞也有低水平的表達。后來發(fā)現(xiàn)另一個造血干細胞標記CD133在成熟血管內(nèi)皮細胞不表達，而且純的CD133+細胞在體外可以分化為內(nèi)皮細胞。故認為CD133+KDR+細胞似乎更能代表EPCs，CD34+KDR+細胞似乎也代表從血管壁脫落的成熟內(nèi)皮細胞，而CD34+/CD133+/KDR+則可能是更為精確的EPCs表型[2]。也有學者將DiI-acLDL和FITC-UEA-I雙染色陽性細胞視為正在分化的內(nèi)皮祖細胞，但是這兩個特性也都能見于成熟內(nèi)皮細胞。

大量研究顯示了血管疾病及其相關危險因素導致EPCs的減少，如糖尿病[3]、腦卒中[4]、高脂血癥[5]、吸煙[6]等。冠狀動脈疾病的患者外周血中EPCs的數(shù)量和疾病的嚴重程度呈負相關[7]，穩(wěn)定型心絞痛患者側支循環(huán)形成的程度與EPCs數(shù)量呈正相關[8]。因此提出循環(huán) EPCs數(shù)量可以綜合反映危險因素，作為內(nèi)皮損傷的標志，是動脈粥樣硬化發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。從而推測，EPCs在動脈粥樣硬化和冠心病發(fā)生和發(fā)展中扮演了重要角色，是一個可能的預測因子。而目前還沒有關于健康人EPCs數(shù)量的系統(tǒng)研究。所以本研究就健康成人為研究對象，測定其外周血CD34+/CD133+/KDR+EPCs的數(shù)量，明確了EPCs的性別差異，為今后進一步深入研究奠定了基礎。經(jīng)體外培養(yǎng)測定細胞功能不存在性別差異，與體內(nèi)細胞數(shù)量結果不一致，推測可能原因為體外培養(yǎng)脫離了雌激素的影響，致性別差異不明顯，且兩種方法測定目的不一樣(數(shù)量和功能)，會存在結果不一致可能。

已有研究結果表明，雌激素能提供多種機制的心血管保護作用，其中可能與EPCs有關[1]。雌激素可能通過EPCs的雌激素受體作用，刺激血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等釋放，促進EPCs的動員、增殖、血管修復作用，并通過抗凋亡作用等影響EPCs數(shù)量[9]。Masuda等[10]的研究顯示在正常婦女的外周血中，EPCs的數(shù)量與雌激素水平呈正相關。有關月經(jīng)周期和心血管事件的研究顯示，患有冠心病的絕經(jīng)前女性患者心肌缺血事件與低雌激素水平相關[11]，急性冠脈事件在月經(jīng)周期早期發(fā)生率升高[12]。從本研究結果分析，循環(huán)EPCs數(shù)量男性明顯低于女性，在女性月經(jīng)周期中卵泡初期明顯低于排卵前期和黃體中期，與心血管風險增加相關，由此推測EPCs可能是心血管疾病的一個保護因子。有關雌二醇對EPCs的體外動員作用，本研究顯示當雌二醇濃度低于1×10-9mol/L時，這種動員作用較弱，但隨著雌二醇濃度的增加，對EPCs的動員是非常明顯的，推測動員EPCs可能是雌激素發(fā)揮作用的路徑之一。

EPCs 在新生血管的形成及其在缺血性心血管疾病的治療和預防中發(fā)揮重要作用。早在2000年由Kalka等[13]將體外擴增后人的外周血EPCs移植到裸鼠下肢缺血模型體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)血管密度增加，缺血明顯改善，下肢殘缺率減少。而后的TOPCARE-AMI研究顯示，經(jīng)冠狀動脈內(nèi)移植骨髓干細胞或外周血來源的EPCs治療急性心肌梗死患者，分別隨訪4個月和1年，移植組患者左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)明顯改善[14]。所以，通過體外擴增為缺血組織提供EPCs以促進血管形成、修復，成為治療動脈粥樣硬化性心血管疾病的一種新策略。更有研究證實人外周血來源的EPCs能被誘導分化為心肌細胞，從而為EPCs細胞移植治療心肌壞死性疾病提供了充分的實驗依據(jù)[15]。

總之，EPCs具有廣泛的應用前景。本研究顯示了循環(huán)EPCs的性別差異和月經(jīng)周期對其的影響，肯定了雌二醇的體外動員作用，進一步深入研究參與EPCs動員的因素，對臨床利用EPCs治療缺血性心血管疾病具有重要意義。

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Genderdifferencesinadultcirculatingendothelialprogenitorcells(EPCs)andeffectofestradiolonarousingofEPCsinvitro

FEI Xiao-hong1, YE Hong-hua1, RUAN Lie-min2, YANG Lu2, LOU Yan-ru3, ZHANG Yi-sheng4, SHEN Xu-ping1

(1DepartmentofCardiology,2DepartmentofPsychiatry,3CentralLaboratory,4DepartmentofObstetrics&Gynecology,NingboFirstHospital,Ningbo315010,China.E-mail:yehonghua@medmail.com.cn)

AIM: To investigate the gender differences and influence of menstrual cycle on the number and activity of adult circulating endothelial progenitor cells (EPCs), and the effect of estradiol on EPCs.METHODSTen men and 10 women were enrolled in the study. Peripheral blood samples of the men were collected only once and peripheral blood samples of the women were collected at each menstrual cycle phase (menstrual, pre-ovulatory and mid-luteal phases). The number of CD34+/CD133+/kinase insert domain-containing receptor (KDR)+EPCs was determined by flow cytometry analysis and the level of circulating estradiol was measured by radioimmunoassay. Mononuclear cells were isolated from the blood and culturedinvitro. After cultured for 7 days, the number and the adhesive capacity of EPCs were observed. The effect of estradiol on the EPCs were detected by transmembrane migration assay and proliferation assay.RESULTSThe number of circulating EPCs was significantly higher in women than that in men (P<0.01), and it was higher at the pre-ovulatory phase and the mid-luteal phase than that at the menstrual phase (P<0.05). After culturedinvitro, the activity of EPCs did not reveal gender difference. In the cells treated with estradiol at concentration of ≥1×10-9mol/L, the capacities of transmembrane migration and proliferation were significantly increased (P<0.05).CONCLUSIONThere are the gender differences of adult circulating EPCs between men and women. The number and activity of adult circulating EPCs may be regulated by menstrual cycle. In addition, estrogen plays an important role in the arousing of EPCs.

Endothelial progenitor cells; Estradiol; Gender differences; Menstrual cycle

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.002