文 文， 賴國祥△， 柳德靈， 張亞彬， 姚麗青, 王愛民

(安徽醫(yī)科大學(xué)福州總院教學(xué)醫(yī)院 1呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，2檢驗(yàn)科，3病理科，福建 福州 350025)

1000-4718(2012)03-0546-04

2011-09-05

2011-12-12

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.Z0516077)

△通訊作者 Tel：0591-22859333；E-mail: laiguoxiang2007@163. com

反復(fù)細(xì)菌感染致大鼠氣道重構(gòu)中結(jié)締組織生長因子的表達(dá)變化及意義*

文 文1， 賴國祥1△， 柳德靈1， 張亞彬2， 姚麗青3, 王愛民1

(安徽醫(yī)科大學(xué)福州總院教學(xué)醫(yī)院1呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，2檢驗(yàn)科，3病理科，福建 福州 350025)

目的探討反復(fù)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)感染致大鼠氣道重構(gòu)中結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)的表達(dá)變化及意義。方法通過多次經(jīng)氣管穿刺注入一定劑量PA菌液，建立大鼠慢性肺部感染模型。觀察氣管及肺組織的病理改變, 測定氣管壁和血管壁厚度。通過免疫組化檢測肺組織CTGF蛋白的表達(dá)，同時(shí)采用real-time RT-PCR方法檢測肺組織CTGF mRNA的表達(dá)變化，分析CTGF表達(dá)與病理改變的相關(guān)性。結(jié)果大鼠感染PA第4周開始，氣管壁厚度和血管壁厚度均較NS組顯著增加(P<0.05)，至第16周，各級支氣管管壁增厚，管腔明顯狹窄，有氣道重構(gòu)和肺氣腫形成。免疫組化以及real-time RT-PCR 結(jié)果顯示CTGF表達(dá)隨著時(shí)間的延長逐漸增強(qiáng)，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與氣管壁和血管壁厚度呈顯著正相關(guān)(r=0.880，r=0.829，P<0.01)。結(jié)論氣道反復(fù)感染銅綠假單胞菌可致大鼠出現(xiàn)氣道重構(gòu)，而CTGF可能參與了氣道重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展過程。

氣道重構(gòu)； 銅綠假單胞菌； 結(jié)締組織生長因子

氣道重構(gòu)(airway remodeling)是慢性阻塞性肺疾病和支氣管哮喘的重要病理特點(diǎn)之一，會(huì)引起氣道阻塞，肺彈性回縮力下降及肺功能的減退。研究發(fā)現(xiàn)，和氣道重構(gòu)密切相關(guān)的病原菌有腺病毒、呼吸道合胞病毒和細(xì)菌[1-3]。然而細(xì)菌導(dǎo)致氣道重構(gòu)的作用機(jī)制目前尚不十分清楚。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)急性加重期的主要責(zé)任病原菌，其感染易形成細(xì)菌生物被膜長期定殖，造成肺部反復(fù)感染[4]。然而反復(fù)銅綠假單胞菌感染能否導(dǎo)致氣道重構(gòu)及其具體機(jī)制目前尚無深入研究。

結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是一種促纖維化生長因子，屬即刻早期反應(yīng)基因家族，具有自分泌和旁分泌功能而影響成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等靶細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成，對氣道重塑性疾病具有重要意義[5]。轉(zhuǎn)化生長因子β1的致纖維化作用主要是由CTGF介導(dǎo)的。本研究旨在通過多次經(jīng)氣管穿刺注入一定劑量銅綠假單胞菌菌液的呼吸道感染方法建立大鼠慢性肺部感染模型，評價(jià)其是否具有氣道重構(gòu)的病理特征，并測定肺組織CTGF的表達(dá)變化，探討其在氣道重構(gòu)中的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 SPF級雄性Wistar大鼠120只，體重(250±10)g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)菌株 銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(抗生素敏感試驗(yàn)質(zhì)控菌株)，編號(hào)ATCC27853，購于衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.3主要實(shí)驗(yàn)藥品、試劑 RNAlater組織保護(hù)液(Qiagen)，Trizol組織裂解液(Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)，PCR試劑盒及熒光定量PCR試劑(SYBR Premix ExTaqTM)(大連TaKaRa公司)，引物(上海生工公司合成)。

2動(dòng)物分組和實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組 大鼠基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分為生理鹽水對照組(NS組，60只)和銅綠假單胞菌感染組(PA組，60只)，每組預(yù)留12只大鼠備用(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)大鼠死亡率估算)，以補(bǔ)充因?qū)嶒?yàn)操作失誤或?qū)嶒?yàn)中不可避免的非人為因素導(dǎo)致死亡的大鼠。并將2組各剩余的48只大鼠隨機(jī)分為0 d、1 d、1周、2周、4周、8周、12周和16周組各6只。

2.2動(dòng)物處理 NS組和PA組分別反復(fù)經(jīng)氣管穿刺注射0.1 mL生理鹽水和0.1 mL銅綠假單胞菌菌液(0.3 mol/L，約相當(dāng)于0.7×1011CFU/L)，2次/周(每周的第1 d和第4 d)，持續(xù)4周，后改為1次/周(每周的第1 d)，持續(xù)4周，停止細(xì)菌感染繼續(xù)觀察大鼠8周。8個(gè)不同時(shí)點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

2.3病理改變程度的判定標(biāo)準(zhǔn)及定量方法 將大鼠右肺中葉嚴(yán)格垂直于支氣管及細(xì)支氣管斷面，矢狀面最大周徑處橫貫取材，約3 mm厚，后固定，切片。組織切片置于顯微測微器(×400)下，在支氣管及細(xì)支氣管橫切面經(jīng)中心點(diǎn)的縱軸和橫軸上測量管壁厚度，測量5個(gè)支氣管環(huán)及血管，取平均值，計(jì)算氣管壁厚度和血管壁厚度。

2.4肺組織免疫組化染色評定方法 根據(jù)免疫組化結(jié)果，觀察各組大鼠肺部氣道上皮細(xì)胞和肺泡間質(zhì)細(xì)胞CTGF陽性著色為棕色顆粒沉積。每張切片隨機(jī)選擇20個(gè)視野(×200)，并計(jì)算陽性的氣道上皮細(xì)胞/總的氣道上皮細(xì)胞的百分率，求出平均值。由2位觀察者采取雙盲法對CTGF染色程度獨(dú)立評價(jià)并進(jìn)行半定量評分：0分：無染色或染色非常弱；1分：陽性細(xì)胞小于25%；2分：彌漫性弱陽性著色；3分：彌漫性中等強(qiáng)度著色；4分：彌漫性強(qiáng)陽性著色。免疫染色片與HE染色片作對照觀察，以確定陽性染色出現(xiàn)的部位。

2.5CTGF real-time RT-PCR分析 細(xì)胞總RNA的提取按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，參照Reverse Transcription System 說明書合成cDNA。根據(jù)NCBI GenBank中人類GAPDH和CTGF mRNA序列，采用Primer3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，見表1。常規(guī)法PCR優(yōu)化擴(kuò)增條件后，于Bio-Rad iCycler PCR儀上行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。本實(shí)驗(yàn)將正常組作為基準(zhǔn)設(shè)為對照組，先將生理鹽水組和銅綠假單胞菌組分別與對照組比較，再將生理鹽水組和銅綠假單胞菌組比較。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 CTGF及GAPDH的引物序列

結(jié) 果

1肺部病理形態(tài)學(xué)改變

第4周:PA組大鼠氣管黏膜下可見大量腺體，杯狀細(xì)胞減少，腺體導(dǎo)管內(nèi)可見黏液栓。細(xì)支氣管黏膜下及周圍可見淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，肺泡間隔略增寬，間質(zhì)充血水腫，肺泡上皮細(xì)胞增生。NS組氣管及支氣管黏膜上皮細(xì)胞排列尚規(guī)整，杯狀細(xì)胞增生，肺內(nèi)各級小支氣管、細(xì)支氣管及其伴行的管壁及周圍有少許中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，血管腔充血。肺泡間隔基本正常，間質(zhì)可見紅細(xì)胞浸潤，見圖1。

第16周: PA組大鼠氣管黏膜上皮細(xì)胞排列紊亂、脫落，黏膜下平滑肌增生明顯，血管充血，支氣管杯狀細(xì)胞增殖，黏膜下層纖維化，平滑肌增厚，細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，出現(xiàn)氣道重構(gòu)表現(xiàn)，呼吸細(xì)支氣管和肺泡管囊狀擴(kuò)張，可見肺氣腫形成，視野中央多個(gè)肺泡相互融合，肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，肺泡間隔斷裂，腔略增大，有的肺泡相互融合形成肺大泡。NS組氣管及支氣管黏膜上皮細(xì)胞排列尚規(guī)整，杯狀細(xì)胞增生，肺內(nèi)各級小支氣管、細(xì)支氣管及其伴行的管壁及周圍有少許中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，血管腔充血。肺泡間隔略增寬，間質(zhì)可見紅細(xì)胞浸潤，見圖1。

2肺組織切片的定量分析

從第2周開始PA組大鼠氣管壁厚度明顯大于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與之伴行的肺小血管管壁亦增厚，從第4周開始厚度明顯大于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

Figure 1. Pathological manifestation of trachea, bronchiole and alveolus of the rats in the 2 groups at the 4th and the 16th weeks(HE staining,×200)

圖1第4周和第16周2組大鼠氣管、細(xì)支氣管和肺泡病理變化

表2 2組氣管壁厚度和血管壁厚度的比較

△P<0.05，△△P<0.01vsNS group at the same time point.

3免疫組化檢測肺組織CTGF蛋白表達(dá)水平

CTGF陽性染色主要定位于氣道纖毛上皮、血管和肺泡間質(zhì)細(xì)胞。NS組大鼠僅少量氣道纖毛上皮細(xì)胞和肺泡間質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)CTGF陽性染色，且顏色淡。PA組大鼠第2周后開始出現(xiàn)氣道纖毛上皮細(xì)胞和肺泡間質(zhì)細(xì)胞CTGF表達(dá)增強(qiáng)，以氣道纖毛上皮細(xì)胞明顯，強(qiáng)于NS組。到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，PA組大鼠的CTGF表達(dá)明顯強(qiáng)于NS組,見圖2。

圖2銅綠假單胞菌感染對肺組織中CTGF蛋白表達(dá)的影響

4肺組織CTGFmRNA表達(dá)水平

隨著銅綠假單胞菌感染時(shí)間的增加CTGF表達(dá)逐漸增強(qiáng)，PA組大鼠感染第1 d后CTGF表達(dá)增強(qiáng)，明顯強(qiáng)于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，PA組大鼠的CTGF表達(dá)明顯強(qiáng)于NS對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 2組大鼠肺組織CTGF mRNA的表達(dá)

△P<0.05,△△P<0.01vsNS group at the same time point.

5肺部氣管和血管壁厚度與CTGF表達(dá)水平相關(guān)性分析

以銅綠假單胞菌組大鼠肺部血管壁和氣管壁厚度為應(yīng)變量Y，CTGF mRNA表達(dá)水平為自變量X，進(jìn)行線性相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)r值見表4(P<0.01)。這說明CTGF表達(dá)與氣管壁和血管壁厚度呈明顯正相關(guān)。

表4大鼠肺部氣管和血管壁厚度與CTGF表達(dá)水平的相關(guān)性

Table 4. Correlation between the expression of CTGF mRNA and the thickness of trachea wall and vessel wall of rats

CorrelatedwithCTGFmRNArPThicknessoftracheawall0.880<0.01Thicknessofvesselwall0.829<0.01

討 論

氣道重構(gòu)是慢性阻塞性肺疾病和支氣管哮喘的重要病理特點(diǎn)之一，會(huì)引起氣道阻塞、肺彈性回縮力下降及肺功能減退。氣道重構(gòu)大多是由于反復(fù)氣道慢性炎癥刺激損傷和不全性修復(fù)所導(dǎo)致[6]，其病理改變包括氣道管壁的增厚，上皮下層纖維化，平滑肌增生肥大，肌成纖維細(xì)胞增生，黏液腺上皮化生和細(xì)胞外基質(zhì)沉積增加[7]。

反復(fù)氣道感染是COPD加重和發(fā)展最主要的原因，但它是否會(huì)引起或加重氣道重構(gòu)，是否會(huì)誘發(fā)COPD，成為COPD發(fā)生的原因？Sethi等[8-9]研究認(rèn)為：感染尤其是細(xì)菌感染，不僅是COPD急性加重的主要原因，很可能是 COPD 發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要因素。許滸等[3]研究發(fā)現(xiàn)，以適量肺炎克雷伯菌和肺炎鏈球菌，多次經(jīng)鼻腔注入大鼠肺內(nèi)，發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)氣道重構(gòu)和肺氣腫，具有 COPD的病理學(xué)特征。在實(shí)驗(yàn)中我們參照許滸等[3]的造模方法，選擇銅綠假單胞菌作為研究對象，這是因?yàn)樵摷?xì)菌與COPD密切相關(guān)，是導(dǎo)致COPD終末期患者反復(fù)急性加重入院的主要致病菌，也是有創(chuàng)通氣患者容易發(fā)生定植的細(xì)菌。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠感染PA后各級支氣管慢性炎癥明顯，管壁增厚，管腔明顯狹窄，有氣道重構(gòu)和肺氣腫形成，也具有COPD的病理特征。因此，我們的結(jié)果表明反復(fù)氣道感染會(huì)導(dǎo)致氣道重構(gòu)，也提示它既是COPD加重和發(fā)展的原因，也可能是COPD發(fā)生的原因。

在許多臟器纖維化的過程中，CTGF mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng)。CTGF的主要作用是：(1)促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂和成纖維細(xì)胞增殖，合成膠原；(2)介導(dǎo)細(xì)胞趨化作用；(3)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；(4)促進(jìn)血管形成[10]。因此本研究也對CTGF在氣道重構(gòu)中的作用進(jìn)行探討，結(jié)果顯示隨著銅綠假單胞菌感染時(shí)間的延長，CTGF在肺內(nèi)的表達(dá)逐漸增加，而且主要表達(dá)位于氣道纖毛上皮細(xì)胞和肺泡間質(zhì)細(xì)胞。不僅如此，我們還將CTGF與氣道壁及血管壁的厚度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果也說明兩者呈顯著正相關(guān)。這些結(jié)果均提示CTGF參與了PA感染大鼠的氣道重構(gòu)過程。至于CTGF如何參與氣道重構(gòu)，推測可能是CTGF作用于下游的核因子，進(jìn)而促進(jìn)氣管及血管平滑肌細(xì)胞增殖，趨化成纖維細(xì)胞，增加細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成，介導(dǎo)白細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致氣道、血管壁增厚，引起氣道重構(gòu)。但這些推測需要在今后的研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，我們的研究表明反復(fù)氣道感染銅綠假單胞菌可致大鼠出現(xiàn)氣道重構(gòu)，可能會(huì)誘發(fā)COPD，而CTGF可能參與了氣道重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展過程。

[1] Kushwah R, Cao H, Hu J. Potential of helper-dependent adenoviral vectors in modulating airway innate immunity[J].Cell Mol Immunol,2007,4(2):81-89.

[2] Li W, Shen HH. Effect of respiratory syncytial virus on the activity of matrix metalloproteinase in mice[J]. Chin Med J (Engl),2007,120(1):5-11.

[3] 許 滸，熊 密，黃慶華,等. 細(xì)菌感染導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的探討[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，1999，22(12)：739-742.

[4] Murphy TF,Brauer AL,Eschberger K,et al.Pseudomonasaeruginosain chronic obstructive pulmonary disease[J]. Am J Respir Crit Care Med,2008,177(8):853-860.

[5] 田 鋒，徐永健，張珍祥，等.CTGF在煙霧暴露大鼠肺血管中的表達(dá)及其與肺血管重建的關(guān)系[J].中國病理生理雜志，2008，24(1)：7-11.

[6] Jeffery PK. Remodeling and inflammation of bronchi in asthma and chronic obstructive pulmonary disease[J]. Proc Am Thorac Soc,2004,1(3):176-183.

[7] Parameswaran K, Willems-Widyastuti A, Alagappan VK, et al. Role of extracellular matrix and its regulators in human airway smooth muscle biology[J]. Cell Biochem Biophys，2006, 44(1): 139- 146.

[8] Sethi S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD[J]. Chest, 2000, 117(5 Suppl 1): 286S-291S.

[9] Sethi S，Murphy TF.Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease[J].N Engl J Med, 2008, 359(22): 2355-2365.

[10]Shimo T,Nakanishi T,Nishida T.Connective tissue growth factor induces the proliferation,migration,and tube formation of vascular endothelial cellsinvitro,and angiogenesisinvivo[J].J Biochem,1999,126(1):137-145.

Roleofconnectivetissuegrowthfactorinairwayremodeledinratsinducedbyrepeatedbacterialinfection

WEN Wen1, LAI Guo-xiang1, LIU De-ling1, ZHANG Ya-bin2, YAO Li-qing3, WANG Ai-min1

(1DepartmentofPulmonaryandCriticalCareMedicine,2DepartmentofLaboratoryMedicine,3DepartmentofPathology,FuzhouGeneralHospital,TeachingHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Fuzhou350025,China.E-mail:laiguoxiang2007@163.com)

AIM: To investigate the role of connective tissue growth factor (CTGF) in airway remodeling in rats induced by repeatingPseudomonasaeruginosa(PA) infection.METHODSThe rats were intratracheally injected with PA for 12 times to induce chronic lung inflammation. The pathological changes of the trachea and lungs were observed, and the thickness of the trachea wall and vessel wall was measured. At the same time, the methods of immunochemistry and real-time quantitative RT-PCR were used to determine the protein and mRNA expression of CTGF in the lung tissues. The relevance between pathological changes and CTGF expression was also analyzed.RESULTSFrom the 4th week, the thickness of the trachea wall and vessel wall in infectious group was larger than that in NS group (P<0.05). At the 16th week, obvious chronic inflammation in all grade bronchi appeared, the trachea walls were thickened and the lumens were narrowed in the infected animals. The expression of CTGF was significantly up-regulated (P<0.01) with positive correlations to the thickness of the trachea wall and vessel wall (r=0.880,r=0.829,P<0.01).CONCLUSIONAirway remodeling in rats is induced by repeated injection of PA. CTGF may play some roles in the pathogenesis of airway remodeling.

Airway remodeling;Pseudomonasaeruginosa; Connective tissue growth factor

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.029