盛桂琴， 呂 賓, 金海峰

(1紹興縣中心醫(yī)院消化科，浙江 紹興 312030；2浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院消化科，浙江 杭州 310006)

1000-4718(2012)03-0556-04

2011-02-24

2011-12-19

△通訊作者 Tel:0571-87032028 ;E-mail：lvbin@medmail.com.cn

溫郁金二萜類化合物C對脂多糖誘導的人胃腺癌SGC7901細胞內(nèi)NF-κB信號通路的影響

盛桂琴1， 呂 賓2△, 金海峰2

(1紹興縣中心醫(yī)院消化科，浙江 紹興 312030；2浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院消化科，浙江 杭州 310006)

目的研究溫郁金二萜類化合物C(RC)對脂多糖誘導的人胃腺癌SGC7901細胞核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)活性影響。方法以10 mg/L脂多糖(LPS)刺激體外培養(yǎng)的SGC7901細胞建立炎癥模型，設(shè)正常對照組、LPS刺激組、RC預干預組(RC干預后以LPS刺激)。蛋白質(zhì)印跡法檢測IKK、p-p65、p65和p-IκBα蛋白表達，凝膠遷移阻滯實驗檢測p65與DNA結(jié)合活性。結(jié)果與炎癥模型組比較，經(jīng)溫郁金二萜類化合物干預后，細胞中的IKK、p-p65、p65和p-IκBα蛋白表達均減少；入核p65蛋白與DNA結(jié)合活性減弱。結(jié)論溫郁金二萜類化合物通過抑制核因子-κB信號通路起抗炎作用。

溫郁金； 二萜類； NF-κB； SGC7901細胞

中藥溫郁金具有行氣化瘀，清心解郁，利膽退黃作用，現(xiàn)代藥理及臨床研究表明，從溫郁金中提取的多種有效成份具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種藥理活性[1]。革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素的脂多糖成份是引起慢性炎癥、敗血癥休克的主要因素。脂多糖持續(xù)刺激機體細胞系統(tǒng)，被宿主脂多糖結(jié)構(gòu)識別受體識別，從而激活一系列信號轉(zhuǎn)導通路，誘發(fā)細胞因子的轉(zhuǎn)錄表達，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)。核因子-κB激活途徑是最重要、研究最多、最常見的炎癥通路，亦是免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和機體發(fā)育過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它在細胞中的定位與活力受到嚴格的調(diào)控。我們前期的實驗結(jié)果表明從溫郁金中提取的二萜類化合物能抑制脂多糖誘導SGC7901細胞的致炎作用。但其抗炎機制有待進一步深入研究。我們以脂多糖誘導SGC7901細胞為炎癥模型，進一步探討溫郁金二萜類化合物C的抗炎作用及機制。

材 料 和 方 法

1材料和儀器

溫郁金二萜類化合物C由本單位與浙江大學藥學院合作提取，分子量380，分子式為C22H36O5以二甲基亞砜(DMSO)溶解成10 g/L，儲存于-20 ℃，用時按需要稀釋。人胃腺癌SGC7901細胞株購自中科院上海細胞庫。NF-κB pathway sample kit(編號為9936)[包括核因子κB抑制蛋白激酶α(IκB kinase α，IKKα)抗體、IKKβ抗體、p65及p-p65抗體、IκBα及其磷酸化蛋白抗體]為Cell Signaling產(chǎn)品，Ⅱ抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG和RPMI-1640購自杭州達文生物有限公司。新生牛血清、杭州四季青公司產(chǎn)品；溶解溫郁金化合物C的DMSO和LPS為Sigma產(chǎn)品。核蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。凝膠遷移阻滯試劑盒(編號為20148)為Thermo，尼龍膜和p65生物素標記探針(GS056B)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，生物安全操作柜(Thermo)，Western blotting電泳儀和電轉(zhuǎn)儀購自Bio-Rad。

2方法

2.1溫郁金二萜類化合物C細胞毒性檢測(MTT法) SGC-7901細胞接種于96孔板中，接種密度2.5×108/L ，每孔200 μL，24 h細胞貼壁后棄去上清，加含不同濃度化合物C的培養(yǎng)液(0、10、20、40、60、80 mg/L)作用24 h，在終止細胞培養(yǎng)前4 h加入20 μL MTT液，終止細胞培養(yǎng)后加入150 μL DMSO于酶標儀測定A490值，抑制率=1-(化合物C組A值-DMSOA值/對照組A值-DMSOA值)求出藥物IC5的值后，進入后續(xù)實驗。

2.2細胞核蛋白及總蛋白提取 將處于對數(shù)生長期的SGC7901細胞接種于面積為6 cm2的培養(yǎng)皿中，當細胞融合至培養(yǎng)皿面積的80%時進行如下處理。設(shè)正常對照組(1‰ DMSO)；LPS組(10 mg/L LPS分別刺激5 min、10 min、15 min、30 min、60 min)；溫郁金化合物(RC)+LPS組(濃度為10 mg/L的RC預處理16 h后，再加入LPS 10 mg/L分別刺激5 min、10 min、15 min、30 min、60 min)。收集細胞，按核蛋白及總蛋白提取操作說明提取蛋白，BCA法測蛋白濃度，保存于-80℃。

2.3Western blotting 方法檢測胞漿中p-IκBα、IKKα、IKKβ，細胞核p-p65蛋白及總蛋白中p65蛋白表達 取50 μg蛋白，煮沸變性后進行十二磺基硫酸鈉/聚丙烯酰胺電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。加入適量上述抗體及內(nèi)參actin多克隆抗體，室溫下旋轉(zhuǎn)孵育2.5 h。加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，室溫下孵育1 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次。結(jié)果用ECL-Plus化學發(fā)光試劑盒檢測，以凝膠成像系統(tǒng)ChemiDocXRS曝光攝像，Ⅰ抗稀釋度為1∶1 000，Ⅱ抗稀釋度為1∶2 000。

2.4凝膠遷移阻滯(electrophoretic mobility shift assay ，EMSA)實驗檢測入核p65與DNA結(jié)合活性 細胞分組設(shè)正常對照組(1‰ DMSO)；LPS組(10 mg/L LPS刺激60 min)；RC+LPS組(10 mg/L RC預處理細胞16 h后，再加入LPS 10 mg/L刺激60 min)；RC組(RC作用16 h)。核蛋白提取同前,參照EMSA試劑盒進行操作，5 μg細胞核提取物加入適量結(jié)合反應(yīng)液、Poly d(I-C)和雙蒸水室溫靜置10 min，加入適量生物素標記探針(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’)使總反應(yīng)體系為20 μL，繼續(xù)室溫靜置20 min后，進行6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，紫外燈下交聯(lián)固定DNA，經(jīng)化學發(fā)光反應(yīng)，洗膜后將膜置于凝膠圖像系統(tǒng)進行掃描。

2.5灰度值檢測 用Adobe Photoshop 7.0軟件來處理，進行各實驗組條帶與對照組條帶灰度值分析，目的條帶與內(nèi)參照條帶代表目的蛋白表達水平，各組目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值比表示目的蛋白相對表達量。

3統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1溫郁金化合物C細胞毒實驗

溫郁金化合物C對SGC7901細胞生長抑制隨著濃度的增加，抑制作用逐漸明顯，其50%的抑制濃度是38．43 mg/L，IC5值(非細胞毒劑量)是10.21 mg/L，取10 mg/L進行實驗。

2WesternBlotting方法檢測胞漿中p-IκBα、IKKα、IKKβ，細胞核p-p65蛋白及總蛋白中p65蛋白表達

細胞經(jīng)LPS刺激后，p65和IκBα蛋白迅速發(fā)生磷酸化，在5 min時點可見明顯磷酸化表達，但在較短時間內(nèi)總p65蛋白、IKKα、IKKβ水平無明顯改變，表明NF-κB信號通路被激活。細胞經(jīng)溫郁金二萜類化合物C預處理后，能顯著抑制LPS對細胞p65、IκBα蛋白的磷酸化作用，細胞總p65蛋白、IKKα、IKKβ蛋白表達下降。表明化合物RC能抑制LPS對NF-κB信號通路的激活作用，見圖1。

3EMSA檢測細胞核內(nèi)p65蛋白與DNA結(jié)合活性影響

正常對照組及溫郁金二萜類化合物組僅檢測到極少量的有活性的p65蛋白，表明溫郁金二萜類化合物不能激活p65；經(jīng)LPS刺激后有活性的p65明顯增加，但經(jīng)溫郁金干預后，再以LPS刺激細胞，p65活性又明顯降低,見圖2。

討 論

由炎癥介導的各種病理損傷目前尚無很好的治療方法。NF-κB是促炎癥基因表達的“樞紐”之一，可誘導細胞因子、趨化因子、黏附因子等的表達[2]。NF-κB的不適當激活是引起炎癥損傷的關(guān)鍵步驟，亦是目前篩選中藥成份中最具潛力的抗炎靶點，應(yīng)用NF-κB抑制劑以減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生成為治療炎癥的新思路。NF-κB存在于多種細胞中，主要以p50/p65異源二聚體形式存在。靜息狀態(tài)下，NF-κB以二聚體與其抑制蛋白(IκB)形成三聚體存在于細胞質(zhì)中，當細胞經(jīng)LPS、白細胞介素1、腫瘤壞死因子等致炎因子作用，經(jīng)一系列的級聯(lián)反應(yīng)， IKKs被激活，導致IκB磷酸化、泛素化，最終被26S蛋白酶體降解。IκB降解后暴露出p50的DNA結(jié)合位點和p65的參與基因轉(zhuǎn)錄的起始調(diào)節(jié)位點，二聚體進入細胞核調(diào)節(jié)特異基因的轉(zhuǎn)錄。這是NF-κB活化的經(jīng)典途徑。亦有研究表明NF-κB活化還有其它途徑，如p65自身磷酸化[3]，入核的p65在細胞核內(nèi)也受到復雜的調(diào)節(jié)，影響其轉(zhuǎn)錄活力的強度、持續(xù)性和特異性等，王琛等發(fā)現(xiàn)一種UXT蛋白具有促進NF-κB 駐留在細胞核內(nèi)，幫助形成并穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄起始復合物的作用[4]。

我們前期的實驗結(jié)果表明，以脂多糖刺激SGC7901細胞能產(chǎn)生大量的炎癥因子，而經(jīng)溫郁金二萜類化合物C預處理細胞后，再以脂多糖刺激細胞，能明顯減輕炎癥因子的釋放。

圖1化合物RC對LPS激活的SGC7901細胞NF-κB信號通路蛋白表達的影響

圖2SGC7901細胞中活化p65蛋白的表達

而本實驗結(jié)果表明，LPS刺激SGC7901細胞后IκBα迅速磷酸化，表明其上游IKKs被激活，IKKs包括催化亞基(IKKα、IKKβ)和調(diào)節(jié)亞基(IKKγ)，而IKKα和IKKβ的量無明顯改變。但經(jīng)溫郁金化合物干預后，IκBα磷酸化明顯受到抑制(詳見圖1)，IKKα和IKKβ的表達量減少。經(jīng)由LPS、TNF、IL-1介導的NF-κB激活，有研究者采用基因敲除方法證明起激活作用的是IKKβ而非IKKα[5]，亦有研究表明二者在IκBα的活化上起聯(lián)合促進作用[6]，結(jié)果不同考慮是否與細胞種屬不同有關(guān)。我們的實驗結(jié)果表明，在LPS刺激的SGC7901細胞中，IκBα磷酸化有可能同時受其上游激酶的量與活性影響，而溫郁金二萜類化合物C是通過減少IKKα和IKKβ的量及改變二者的活性起作用。在LPS刺激SGC7901細胞的實驗中，p65蛋白也是迅速發(fā)生磷酸化的，但其總量無改變，而經(jīng)溫郁金化合物C干預后p65磷酸化受到抑制，表明溫郁金化合物C可能直接抑制p65磷酸化，但亦有可能通過IKKs途徑來抑制p65磷酸化，因為IKKs蛋白量發(fā)生了改變。Sakurai等[7]報道，過表達的IKKα或IKKβ能直接誘導p65磷酸化。

入核的p65只有與DNA結(jié)合才能發(fā)揮作用，否則只能被降解或重新回到細胞漿中，而p65磷酸化、乙酰化在DNA結(jié)合性及反式激活上起主要作用[7]。本實驗中，LPS組NF-κB的DNA結(jié)合活性最強，而溫郁金化合物C能減弱LPS的NF-κB與DNA的結(jié)合活性。但溫郁金化合物究競是通過何種方式削弱入核的p65與DNA結(jié)合力仍需進一步闡明。

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EffectsofditerpenoidCfrometherextractofRadixCurcumaeonnuclearfactor-κBactivityinLPS-inducedhumangastricadenocarcinomaSGC7901cells

SHENG Gui-qin1, Lü Bin2, JIN Hai-feng2

(1DepartmentofGastroenterology,CentralHospitalofShaoxingCounty,Shaoxing312030,China;2DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310006,China.E-mail:lvbin@medmail.com.cn)

AIM: To observe the effects of diterpenoid C from ether extract ofRadixCurcumae(RC) on the activity of nuclear factor-κB in human gastric adenocarcinoma SGC7901 cells stimulated with lipopolysaccharide (LPS).METHODSSGC7901 cells were normally cultured, induced by LPS, or treated with LPS plus RC. The protein expression of IKKα, IKKβ, p65, phosphorylated p65 and phosphorylated IκBα was assayed by Western blotting. NF- κB DNA binding activity was determined by electrophoretic mobility shift assay.RESULTSRC reduced the protein expression of IKKα, IKKβ, p65, phosphorylated p65 and phosphorylated IκBα induced by LPS. NF-κB DNA binding activity increased much greatly by LPS stimulation, while RC resisted the action of LPS.CONCLUSIONRC may attenuate the secretion of inflammatory cytokines by inhibiting the activation of NF-κB signaling pathway.

RadixCurcumae; Diterpenes; NF-kappa B; SGC7901 cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.032