張玲，王德群，查日維，宗鎮(zhèn)，張珂

（安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230031）

覆盆子中山柰酚的TLC鑒別和HPLC測定△

張玲，王德群*，查日維，宗鎮(zhèn)，張珂

（安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230031）

目的：研究覆盆子藥材中山柰酚的TLC鑒別和HPLC測定方法。方法：以硅膠G為固定相，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（9∶3∶1）為展開劑，1%三氯化鋁乙醇液為顯色劑，建立覆盆子藥材中山柰酚的TLC鑒別方法；以甲醇-0.4%磷酸（55∶45）為流動相，大連依利特色譜柱，流速1 mL·min－1，在360 nm處進(jìn)行山柰酚的HPLC測定。結(jié)果：TLC能檢測出山柰酚的特征斑點；山柰酚在HPLC進(jìn)樣0.010 4～0.052μg線性關(guān)系良好。結(jié)論：該方法簡單、可行，可用于覆盆子藥材的質(zhì)量控制。

覆盆子；山柰酚；薄層色譜法；高效液相色譜法

覆盆子為薔薇科植物華東覆盆子Rubus chingiiHu的干燥未成熟果實，具有益腎固精縮尿，養(yǎng)肝明目的功能，用于治療遺精滑精，遺尿尿頻，陽痿早泄，目暗昏花［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明覆盆子具有溫腎助陽、抗誘變、延緩衰老、增強(qiáng)免疫活性、抑菌等藥理作用［2-4］。覆盆子的化學(xué)成分主要為黃酮、三萜、有機(jī)酸和甾醇等［5-7］，其中山柰酚及其苷類為覆盆子黃酮類化合物中最常見的成分之一，具有防癌、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒等多種功效［8］。覆盆子中山柰酚的定性定量分析目前未見報道，本文以山柰酚為指標(biāo)性成分，建立覆盆子藥材中山柰酚的薄層色譜（TLC）鑒別和高效液相色譜（HPLC）測定方法，并對不同采收期覆盆子中的山柰酚進(jìn)行比較，以期為覆盆子的質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-10AIVP高效液相色譜儀（日本）；LC solution色譜工作站；HHS型電熱恒溫水浴鍋；HS3120超聲波清洗器；CP225D型十萬分之一電子天平；WFH-203B三用紫外分析儀。

山柰酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110861-200808）；覆盆子采自安徽青陽，并由安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院張珂老師鑒定為華東覆盆子Rubus chingiiHu的干燥未成熟果實；甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

取覆盆子樣品粉末約2 g，精密稱定，加70%乙醇75 mL，浸泡30 min，超聲45 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL溶解，用石油醚（60～90℃）萃取2次，每次20 mL，棄去石油醚液，水液加稀鹽酸20 mL，置水浴中加熱1 h，取出，迅速冷卻（流水冷卻），用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，減壓回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯浸膏，干燥，用甲醇溶解，并移至5 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取山柰酚對照品，加甲醇制成每1 mL含0.78 mg的溶液，作為對照品溶液。

照薄層色譜法（2010版 《中國藥典》一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述兩種溶液各1μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（9∶3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁-乙醇溶液，吹干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，見圖1。

2.2 HPLC測定

2.2.1 色譜條件 大連依利特Hypersil ODS-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸（55∶45），流速為 1.0 mL·min－1，檢測波長為360 nm；柱溫為25℃；進(jìn)樣量：20μL。理論板數(shù)按山柰酚峰計算，應(yīng)不低于3 000。色譜圖見圖2。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取山柰酚對照品適量，加甲醇制成每1 mL含山柰酚0.026 mg的溶液，作為對照品貯備液。精密吸取貯備液0.6 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，得對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取覆盆子藥材粉末約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，精密加入鹽酸5 mL，置90℃水浴中加熱水解1 h，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取山柰酚對照品貯備液 （0.026 mg·mL－1） 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL置10 mL量瓶中，加入50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別吸取上述溶液20μL，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定峰面積，以進(jìn)樣濃度（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)作圖，得山柰酚回歸方程為A＝618 009C－780 22（r＝0.999 4）。結(jié)果表明，山柰酚在進(jìn)樣 0.010 4～0.052μg線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗 取同一份對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值，結(jié)果山柰酚峰面積平均值為367 954，RSD＝0.72%（n＝6）。表明本方法的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份樣品溶液，分別放置0，2，4，6，8，12 h，按上述色譜條件，分別測定峰面積積分值，結(jié)果山柰酚的峰面積平均值為770 694，RSD＝1.79%（n＝6），表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 分別精密稱取同一批覆盆子樣品各6份，按上述方法分別測定峰面積積分值，結(jié)果山柰酚的平均含量為 0.096 mg·g－1，RSD＝2.57%（n＝5），表明本方法的重復(fù)性較好。

2.2.8 加樣回收率試驗 分別精密稱取已知含量的同一批覆盆子藥材粉末6份，每份0.8 g。分別精密加入0.07 mg的山柰酚對照品，按供試品溶液制備項下的方法制備樣品溶液，再依法測定山柰酚的含量，結(jié)果山柰酚的平均加樣回收率為95.26%，RSD＝2.01%（n＝6）。表明本法的準(zhǔn)確性較好。

2.2.9 不同采收期覆盆子中山柰酚的含量測定結(jié)果按照上述測定方法，測定了安徽青陽不同采收期覆盆子中山柰酚的含量，結(jié)果見表1。

表1 不同采收期覆盆子中山柰酚的含量/mg·g－1

從表1可以看出，6月1日采收的覆盆子中山柰酚的含量最高，5月20日采收的含量最低。

3 討論

研究表明，極大多數(shù)黃酮苷類化合物口服后，首先在消化道上皮細(xì)胞水解酶或腸道微生物作用下，轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的黃酮苷元而被吸收，口服黃酮苷類化合物的效應(yīng)成分多為其苷元［9］。鑒于上述原因，本實驗建立了覆盆子中酸水解山柰酚的TLC鑒別和HPLC測定方法。

覆盆子的薄層色譜鑒別條件摸索，參考了多種藥材的山柰酚TLC展開條件，分別考察了甲苯-乙酸乙酯-甲酸（9∶3∶1）（9∶1∶1）兩種不同比例的溶液為展開劑進(jìn)行展開，結(jié)果9∶3∶1效果較好，鑒別斑點清晰、明確。另外進(jìn)行了固定相聚酰胺和硅膠G的比較，結(jié)果硅膠G的斑點位置清晰、易于辨認(rèn)。所以確定薄層條件為硅膠G薄層板，展開劑甲苯-乙酸乙酯-甲酸（9∶3∶1）。

考察了流動相甲醇-0.4%磷酸（50∶50）、（55∶45）、（60∶40）3種不同比例的流動相對峰形的影響，結(jié)果以（55∶45）比例的流動相峰形較好。另外進(jìn)行了流速的考察，結(jié)果1.0 mL·min－1出峰時間、峰形較好。

本實驗建立的覆盆子中山柰酚的TLC鑒別和HPLC測定方法，操作簡便、快速，準(zhǔn)確性和精密度較高。

［1］國家藥典委員會.中國藥典［S］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：359.

［2］程科軍.Ⅰ.覆盆子活性成分研究，Ⅱ.金雀根中二苯乙烯類成分的穩(wěn)定性研究［D］.上海：復(fù)旦大學(xué)，2008.

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Identification and Determ ination of Kaem pferol in Rubi Fructus by TLC and HPLC

ZHANG Ling，WANG De-qun，ZHA Ri-wei，ZONG Zhen，ZHANG Ke
（Department of Pharmacy，Anhui College of Traditional Chinese Medicine＆Anhui Key Laboratory of Modern Chinese Materia Medica，Hefei230031，China）

Objective：To study the identification method by TLC and the determination method by HPLC of kaempferol in Rubi Fructus.Methods：TLC was used in the identification，silica G was used as the stationary phase，the proportion of methylbenzene-ethyl acetate-methanoic acid（9∶3∶1）was themobile phase.The plateswere sprayed with 1% aluminium choride of ethanol and heated to 105℃for 5 min.HPLC was used in the determination.A C18column was used with amixture of methanol and 0.4% phosphoric acid solution（55∶45）as themobile phase，the rate was 1 mL·min－1with the detection wavelength at 360 nm.Results：The characteristic spot of kaempferol was examined by TLC，themethod was proved to be linear over the range of 0.010 4～0.052μg for kaempferol by HPLC.Conclusion：Themethod is simple and feasible，it provides amethod for the quality control of Rubi Fructus.

Rubi Fructus；Kaempferol；TLC；HPLC

2011-10-07）

安徽省自然科學(xué)基金項目（090413101），安徽中醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)研究基金項目（2011zr0198）

*［通訊作者］王德群，Tel：（0551）5165884，E-mail：ahwdq＠yahoo.com.cn