曾旭，李秋實，王鈐，謝麗芳，張亞蘭，羅焜，劉志華，3*

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210089；3.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院信息中心，北京 100730；5.北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100083）

基于ITS2條形碼的五加皮基原植物及其易混品的鑒定△

曾旭1，2，李秋實1，王鈐1，謝麗芳4，張亞蘭5，羅焜1，劉志華1，3*

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210089；3.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院信息中心，北京 100730；5.北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100083）

目的：對五加皮基原植物及其易混品進行分子鑒別，為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。方法：從GenBank數(shù)據(jù)庫下載五加皮基原植物及其易混品的ITS2序列，經(jīng)CodonCode Aligner，MEGA4.0等軟件進行序列拼接和分析，構(gòu)建NJ（鄰接）、ME（最小進化）樹，并應(yīng)用Koetschan等建立的ITS2數(shù)據(jù)庫及其網(wǎng)站預(yù)測ITS2二級結(jié)構(gòu)輔助分析。結(jié)果：基于ITS2序列的兩種系統(tǒng)聚類樹都易于將五加皮基原植物細柱五加與其易混品鑒別開；比較與細柱五加親緣關(guān)系較近的同屬易混品二級結(jié)構(gòu)可以看出，細柱五加在螺旋區(qū)莖環(huán)的數(shù)目、大小、位置以及螺旋臂由中心環(huán)伸出時的轉(zhuǎn)角等方面，與其易混品間具有較明顯區(qū)別。結(jié)論：ITS2序列可以將五加皮基原植物及其易混品區(qū)分開，在藥用植物基原鑒定方面具有重要應(yīng)用價值。

五加皮；DNA條形碼；ITS2；分子鑒定

五加皮為五加科五加屬植物細柱五加Acanthopanax gracilistylusW.W.Smith的干燥根皮［1］，具有收斂固澀，益氣生津，補腎寧心等功能［2］。五加皮用藥歷史悠久，地方習(xí)用品種較多，混用現(xiàn)象較為嚴重。易混品主要有五加科植物糙葉五加A.henryi、紅毛五加A.giraldii，蘿藦科植物杠柳Periploca sepium［3］。此外還有五加科植物剛毛五加A.simonii、白簕花A.trifoliatus、無梗五加A.sessiliflorus、刺五加A.seticosus、多蕊木Tupidanthus calyptratus，茄科植物枸杞Lycium chinense、寧夏枸杞L.barbarum，茜草科植物牛白藤Hedyotis hedyotidea等［4-14］。由于正品與易混品之間單靠傳統(tǒng)鑒別方法鑒定存在較大難度，所以本研究采用DNA條形碼技術(shù)，以目前倍受關(guān)注的ITS2序列片段為條形碼［15-23］標(biāo)準(zhǔn)，對五加皮基原植物及其多種易混品進行DNA條形碼鑒別研究，建立該藥材的分子鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

所用ITS2序列均從GenBank數(shù)據(jù)庫下載，詳見表1。

表1 五加皮基原植物及其易混品樣本來源表

1.2 數(shù)據(jù)分析

樣本數(shù)據(jù)使用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法進行分析，去除兩端5.8S和26S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列。對包括五加皮基原植物與其易混品的17條ITS2序列使用CLUSTALX軟件進行序列比對分析，并用MEGA 4.0軟件對結(jié)果進行種內(nèi)、種間遺傳距離的計算。計算基于Kimura 2-Parameter（K2P）雙參數(shù)模型，用 NJ鄰接法（Neighbour-2-Joining Method，NJ）和最小進化法（Minimum Evolution，ME）將比對過的序列構(gòu)建成系統(tǒng)發(fā)育樹（1000次重復(fù)bootstrap檢驗各分支的支持率）以直觀鑒定各物種［24］。最后，使用德國Koetschan等［25］建立的 ITS2網(wǎng)站 http：//its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de/cgi-bin/index.pl預(yù)測 ITS2二級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列比較

五加皮基原植物細柱五加的ITS2序列長度為230 bp，具有一個Poly C結(jié)構(gòu)和一個Poly A結(jié)構(gòu)，GC含量分別為62.2%，五加皮基原植物與其主要易混品ITS2序列間存在較多的變異位點，根據(jù)Kimura 2-parameter（K2P）參數(shù)遺傳距離模型計算得到的序列間遺傳距離，種間平均K2P距離為0.371。與細柱五加遺傳距離最遠的為杠柳，距離值為0.675，距離最近的為剛毛五加，距離值為0.028。

2.2 聚類分析

基于ITS2序列，通過鄰接法（NJ）所構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹圖（圖1）可以看出，五加科植物和其中的五加屬（Acanthopanax）植物分別都聚集為一枝，支持率為100%和93%，而細柱五加的不同樣本數(shù)據(jù)聚在一枝，支持率為93%，并且枝長較短，表現(xiàn)出單系性。與其他同屬植物，包括紅毛五加，無梗五加，刺五加，剛毛五加，白簕花，以及與其同科植物多蕊木，都能由分枝的枝長和支持率的不同，明顯區(qū)分而鑒別開來。此外，杠柳的3個樣本數(shù)據(jù)相聚為一枝，與細柱五加差別非常明顯。枸杞和寧夏枸杞聚集為一枝，牛白藤獨自為一枝，與細柱五加區(qū)別明顯。

基于ITS2序列構(gòu)建的五加皮基原植物及其易混品的最小進化樹（ME）（圖2）與鄰接法（NJ）所構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹對比可以反映出，細柱五加的4個樣本都聚集為一枝，枝長較短，都支持了單系性的特點。對比結(jié)果還反映出，利用ITS2序列來鑒別五加皮基原植物與其易混品，無論與正品親緣關(guān)系遠近，都有很好的鑒別效果。

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建的五加皮基原植物及其易混品的鄰接（NJ）樹

圖2 基于ITS2序列構(gòu)建的五加皮基原植物及其易混品的最小進化樹（ME）

2.3 五加皮基原植物及其主要易混品ITS2序列二級結(jié)構(gòu)

從五加皮基原植物與其主要易混品ITS2二級結(jié)構(gòu)比較可以看出，主要差異位于螺旋（Helix）Ⅰ區(qū)和Ⅲ區(qū)，表現(xiàn)在莖環(huán)（Loop）的數(shù)目、大小、位置以及螺旋臂由中心環(huán)伸出時的轉(zhuǎn)角，不同物種間有或多或少的區(qū)別。如圖3所示，細柱五加二級結(jié)構(gòu)螺旋Ⅰ頂部存在2個小莖環(huán) （Loop）相距較遠，而刺五加和杠柳2個物種二級結(jié)構(gòu)螺旋Ⅰ頂部的莖環(huán)在大小及位置上均與細柱五加存在明顯區(qū)別。細柱五加二級結(jié)構(gòu)螺旋Ⅲ的莖環(huán)在數(shù)量、大小及位置與其他物種也存在明顯不同。此外，細柱五加二級結(jié)構(gòu)螺旋Ⅱ頂部的莖環(huán)在數(shù)量、大小及位置與無梗五加區(qū)別較大，因此，ITS2二級結(jié)構(gòu)也可作為輔助鑒別手段。

圖3 五加皮及其易混品的ITS2二級結(jié)構(gòu)比較

3 討論

ITS2作為DNA條形碼序列，可以有效地將五加皮基原植物與其易混品區(qū)分開。ITS2二級結(jié)構(gòu)用于親緣關(guān)系較近的同屬易混品的鑒定，可以直觀地區(qū)分五加屬的多種植物，鑒別五加皮的易混品種［26-29］。同時，由鄰接（NJ）法構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹和最小進化樹（ME）皆可以看出，細柱五加的4種不同樣本都單獨聚集為一枝，支持率分別達到93%和78%，并且枝長較短，體現(xiàn)出較強的單系性，說明了細柱五加與其他易混品種極易區(qū)分。此外，在兩種聚類圖中，五加屬植物聚集為一枝（支持率＞93%）；五加科植物聚為一枝（支持率皆為100%）。以上證據(jù)說明不同屬、不同科的植物，利用ITS2作DNA條形碼序列，能夠非常準(zhǔn)確地區(qū)分開來。有文獻報道，五加屬植物、多蕊木屬植物親緣關(guān)系較近，亦有人曾提出 “五加屬可能起源于多蕊木屬”的論點［30］，從本研究結(jié)果也可以看出五加屬植物與多蕊木屬植物具有密切的親緣關(guān)系。綜上所述，ITS2作為DNA條形碼序列不僅能區(qū)別五加皮基原植物與其易混品，同時，對于探討五加屬的分類學(xué)關(guān)系亦能起到重要的參考價值。

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Molecular Identification of Acanthopanacis Cortex Original Plant and Its Adulterants Based on ITS2 DNA Barcode

ZENG Xu1，2，LIQiu-shi1，WANG Qian1，XIE Li-fang4，ZHANG Ya-lan5，LUO Kun1，LIU Zhi-hua1，3
（1.Institute of Medicinal Plants Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing100193China；2.China Pharmaceutical University，Nanjing210098China；3.Nanjing Forestry University，Nanjing210037China；4.Information Center，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing100032China；5.Development of Pharmaceutical Sciences，Beijing City University，Beijing100083China）

Objective：To discriminate Acanthopanacis cortex original plant and its adulterants，and assure the authenticity and clinical curative effect of thismedicalmaterial.Methods：Download the ITS2 barcode sequences ofAcanthopanax gracilistylusand its adulterants from GenBank database.Sequence assembly and consensus sequence generation were performed using the CodonCode Aligner.Sequence analyseswere carried outby MEGA4.Phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining and Kimura 2-parameter methods.The ITS2 secondary structure was predicted using the ITS2 database and website found by Schultz et al.Results：In the two cluster dendrograms，Acanthopanax gracilistylusand its adulterantswere observed in a significant difference.To compare the ITS2 secondary structure of the origin plants of Acanthopanacis Cortex and its adulterants，we noticed that there were obviously distinguishes from other species in the number，size，position of loop and the angle of helix exsertion.Conclusion：ITS2 can be used to correctly identifyAcanthopanax gracilistylusand its adulterants，and it has a broad application prospect in the identification of Traditional Chinese Medicine.

Acanthopanax gracilistylus；DNA barcoding；ITS2；Identification

2011-11-23）

國家自然科學(xué)基金（81102746，81100077），北京市自然科學(xué)基金（5113033），國家人事部留學(xué)回國人員科技活動擇優(yōu)資助項目，美國中華醫(yī)學(xué)會基金（A2009001），國家科技重大專項（2012ZX09301-002-001-025），協(xié)和青年基金，協(xié)和新星

* ［通訊作者］劉志華，Tel：（010）57833112，E-mail：zhliu＠implad.ac.cn