張艷芬，時海浪，王培瑩，喬曉強，劉中成

（1．河北大學 實驗室管理辦公室，河北 保定 071002；2．河北大學 藥學院，河北 保定 071002）

大鼠Fcε3－4基因克隆及原核表達

張艷芬1，時海浪2，王培瑩2，喬曉強2，劉中成2

（1．河北大學 實驗室管理辦公室，河北 保定 071002；2．河北大學 藥學院，河北 保定 071002）

為了獲得重組Fcε3－4蛋白，從變態(tài)反應(yīng)性哮喘大鼠脾組織中提取總RNA，通過RT－PCR方法克隆大鼠Fcε3－4基因，構(gòu)建成原核表達載體p ET17b－Fcε3－4，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行誘導表達，F(xiàn)cε3－4蛋白主要以包涵體形式存在．經(jīng)Ni－NAT親和層析柱對尿素溶解的Fcε3－4蛋白進行了純化，并利用降低尿素梯度的方法柱上對純化蛋白進行了復(fù)性．經(jīng)Western Blotting和ELISA鑒定，F(xiàn)cε3－4蛋白具有Fcε的免疫特異性，能被抗大鼠Fcε抗體特異性識別，為下一步研究該蛋白奠定了基礎(chǔ)．

大鼠；Fcε3－4基因；克?。槐磉_；免疫特異性

變態(tài)反應(yīng)性疾病發(fā)病機制至今仍不太清楚，目前尚沒有肯定的治愈方法，其發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，已成為全球性的社會衛(wèi)生問題．免疫球蛋白E在變態(tài)反應(yīng)性疾病發(fā)病機制中具有重要作用，以IgE／FcεRI信號通路為靶點設(shè)計藥物，已經(jīng)成為治療變態(tài)反應(yīng)性疾病藥物開發(fā)的一個新靶點和研究熱點［1－2］．

Ig E恒定區(qū)由4個部分組成，其中Ig E－Fc的Cε2區(qū)域?qū)τ贗gE與其受體FcεRI的結(jié)合沒有明顯的影響．Fcε3－4（Cε3－Cε4）區(qū)是與FcεRI作用的關(guān)鍵區(qū)域，其作用模式等同于IgE與其受體FcεRI的作用模式［3］．為進一步研究及應(yīng)用Ig E Fc區(qū)，本研究運用RT－PCR技術(shù)克隆出大鼠Fcε3－4基因，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET17b－Fcε3－4，并在大腸桿菌中進行了表達．利用鎳柱親和層析一步法柱上純化、復(fù)性了Fcε3－4蛋白，為進一步研究Fcε3－4蛋白奠定了基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1．1 主要材料和試劑

大腸桿菌E．coliBL21，質(zhì)粒p ET17b均由本實驗室保存；DNA聚合酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker等分子生物學試劑購自TakaRa公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、蛋白質(zhì)Marker、引物等購自上海生工公司；Ni－NTA柱購自Bio Basic公司；綿羊抗大鼠IgE多抗購自Serotec公司；兔抗綿羊IgG購自北京中杉金橋公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純．

1．2Fcε3－4基因克隆

卵蛋白（OVA）免疫激發(fā)法制備大鼠哮喘模型，取脾臟液氮凍存，參照文獻方法RT－PCR擴增Fcε3－4基因［4］．根據(jù)所選用載體pET17b序列特征設(shè)計引物，上游引物：5’－GGGAATTCCATATGGATGATGAGCCCCGGGGTG－3’，下游引物：5’－CGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGTCATGGAGGC－3’，劃線處序列分別為NdeI，Eco RI酶切位點，斜體序列為His標簽．引物由上海生工公司合成．

1．3 原核表達載體的構(gòu)建及鑒定

用限制性內(nèi)切酶Nde I和Eco R I對質(zhì)粒p ET17b和PCR回收產(chǎn)物進行雙酶切，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌．隨機挑取單菌落提取質(zhì)粒DNA，PCR和雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，選陽性重組質(zhì)粒送上海生工公司測序．

1．4 Fcε3－4蛋白誘導表達

挑取含有測序正確質(zhì)粒的單菌落至含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，將菌液按1∶100體積比接入新鮮含氨芐青霉素培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達0．6～0．8，加入IPTG至終濃度為1 mmol／L，37℃振蕩培養(yǎng)4．5 h，誘導目的蛋白表達．離心收集菌液，并用PBS重懸菌體，超聲破碎后，收集上清液和沉淀，進行SDS－PAGE觀察表達結(jié)果．設(shè)空載體作陰性對照．

1．5 Fcε3－4蛋白純化及柱上層析復(fù)性

用含2 mol／L尿素、體積分數(shù)1%的Triton X－100的PBS緩沖液洗滌超聲破菌后的沉淀，將洗滌后沉淀溶解于含8 mol／L尿素的PBS緩沖液，注入Ni－NAT親和層析柱．復(fù)性前所用平衡緩沖液為50 mmol／L p H7．4的磷酸緩沖液（0．5 mol／L NaCl，8 mol／L尿素，20 mmol／L咪唑）和0．5 mol／L p H 5．0的醋酸緩沖液．然后分別用含6．0，4．0，2．0 mol／L的尿素復(fù)性緩沖液（0．5 mmol／L GSSG，5 mmol／L GSH，體積分數(shù)10%的甘油，500 mmol／L NaCl，20 mmol／L Tris－HCl，20 mmol／L咪唑，p H8．0）進行梯度洗滌，逐步去除尿素．然后用50 mmol／L咪唑洗脫復(fù)性后的目的蛋白．PBS透析目的蛋白，經(jīng)SDS－PAGE進行分析．

1．6 Western Blotting及間接ELISA分析Fcε3－4特異性

Fcε3－4蛋白經(jīng)SDS－PAGE后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上．用質(zhì)量分數(shù)5．0%的BSA封閉2．5 h，綿羊抗大鼠Ig E多抗4℃過夜孵育，用HRP標記的兔抗綿羊IgG二抗室溫孵育1 h，每次處理前均用TBST洗膜3次．ECL試劑曝光顯影定影分析．

將Fcε3－4蛋白梯度稀釋（0，5，10，20，40，80μg／m L）后包被96孔板．依次加入綿羊抗大鼠Ig E多抗和HRP標記的兔抗綿羊Ig G二抗，用OPD顯色，于波長492 nm用酶標儀測定每孔的光吸收值，同時以PBS為陰性對照．

2 結(jié)果

2．1Fcε3－4基因克隆

提取大鼠脾臟總RNA，OD260／OD280為1．95，RNA帶型清晰，符合實驗要求（圖1）．利用所設(shè)計的特異性引物擴增目的基因后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見特異性目的條帶，其大小同理論值相一致（圖2）．

圖1 大鼠脾組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig．1 Agarose gel electrophoresis analysis total RNA from rat spleen

圖2Fcε3－4基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig．2 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR product ofFcε3－4 gene

2．2 重組表達質(zhì)粒pET17b－Fcε3－4鑒定

重組質(zhì)粒p ET17b－Fcε3－4經(jīng)Nde I和EcoR I雙酶切，可產(chǎn)生702 bp大小片段（圖3）．測定序列與理論序列相一致，表明重組表達載體p ET17b－Fcε3－4構(gòu)建成功．

圖3 重組表達載體p ET17b－Fcε3－4的雙酶切鑒定Fig．3 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant expression vector pET17b－Fcε3－4

2．3Fcε3－4基因的表達

挑陽性菌落培養(yǎng)并誘導表達，菌體經(jīng)超聲破碎后，SDS－PAGE結(jié)果顯示（圖4），在破碎后沉淀中29 ku附近有1條過量表達蛋白帶，與目的蛋白的預(yù)期值相符．空載體對照組全菌、破碎后上清液及沉淀中質(zhì)粒誘導均未發(fā)現(xiàn)目的蛋白表達，表明Fcε3－4基因在宿主細胞中得到表達且表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在．

圖4 表達的Fcε3－4蛋白SDS－PAGE分析Fig．4 SDS－PAGE analysis of expressed Fcε3－4 protein

2．4 Fcε3－4蛋白純化

Fcε3－4蛋白包涵體經(jīng)洗滌、溶解，Ni－NAT復(fù)性純化后經(jīng)SDS－PAGE分析顯示（圖5），包涵體經(jīng)8 mol／L尿素溶解后與鎳柱結(jié)合，經(jīng)低濃度尿素逐級洗脫可去除大量雜蛋白．50 mmol／L咪唑洗脫液洗脫下大部分目的蛋白，200 nmol／L咪唑洗脫液將目的蛋白全部洗脫．

圖5 重組蛋白親和層析純化SDS－PAGE分析Fig．5 Purification of Fcε3－4 on Ni－NTA agarose affinity column by SDS－PAGE analysis

2．5 Western Blotting鑒定

純化、復(fù)性、透析后的Fcε3－4蛋白經(jīng)Western Blotting分析顯示，在約29 ku處檢測到陽性信號，表明純化后的融合蛋白能夠被羊抗鼠Ig E抗體識別，陰性對照中未見陽性信號（圖6）；間接ELISA檢測顯示，F(xiàn)cε3－4蛋白可被羊抗鼠Ig E抗體所識別，并表現(xiàn)出了濃度依賴性（圖7）．

圖6 重組蛋白Fcε3－4的Western Blotting分析Fig．6 Western Blotting profile of purified recombinant Fcε3－4 protein

3 討論

圖7 重組蛋白Fcε3－4間接ELISA分析Fig．7 Indirect ELISA analysis of recombinant Fcε3－4 protein

自1966年日本學者Ishizaka發(fā)現(xiàn)IgE以來，IgE與其受體FcεRI信號通路一直是變態(tài)反應(yīng)疾病藥物研究的熱點，并且隨著2003年FDA批準人源化抗IgE抗體m Ab E25上市，以IgE為靶點開發(fā)藥物的可行性得到了證實［5］．IgE重鏈由4個恒定區(qū)組成（Cε1－Cε4），其中Cε3位點是與受體直接結(jié)合的部位，Cε2和Cε4位點不與FcεRI直接作用，可能在穩(wěn)定Ig E－FcεRI復(fù)合體及阻止Ig E從其受體上解離方面起一定作用［6］．研究顯示，F(xiàn)cε3－4（Cε3－Cε4）區(qū)與FcεRI作用模式和Ig E與其受體FcεRI的作用模式相一致［3］．另文獻報道，Ig E與其受體結(jié)合時種屬特異性較強，人Ig E分子與鼠Ig E受體不能結(jié)合，鼠Ig E分子卻可與人Ig E受體相結(jié)合［7－8］，因此，為了方便利用動物及細胞模型研究Fcε3－4功能，本實驗克隆并在原核系統(tǒng)中表達了大鼠Fcε3－4基因．由于Ig E在正常個體中表達量極低，本課題組參照相關(guān)文獻，通過先制備哮喘大鼠，使大鼠處于致敏狀態(tài)，以提高Ig E基因表達豐度，通過常規(guī)RT－PCR方法順利克隆了Fcε3－4基因．

Ig E的Fc區(qū)體外表達已有大量研究，但此蛋白疏水性較強，原核表達中大多以包涵體形式存在，復(fù)性較為困難．本文比較了不同的復(fù)性方法，發(fā)現(xiàn)用常規(guī)稀釋法和尿素濃度梯度透析法均不能復(fù)性Fcε3－4蛋白，只有層析復(fù)性法獲得可溶性的Fcε3－4蛋白，并且恢復(fù)了Fcε3－4蛋白的免疫特異性，與趙曉瑜等［9］原核表達蚯蚓抗菌肽的結(jié)果相一致．原因可能是利用變性蛋白與層析介質(zhì)的相互作用而抑制蛋白質(zhì)聚集，每個蛋白分子是相對獨立的，易于正確折疊［10－11］．層析復(fù)性克服了透析復(fù)性容易出現(xiàn)蛋白聚集導致復(fù)性失敗的缺點，同時避免了稀釋復(fù)性后體積過大，濃縮困難的弊端［12］．經(jīng)Western Blotting和ELISA檢測表明，所獲Fcε3－4蛋白已暴露出其抗原表位，可被抗Ig E抗體所識別，為進一步研究該蛋白奠定基礎(chǔ)．

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（責任編輯：趙藏賞）

Cloning and prokaryotic expression of ratFcε3－4 gene

ZHANG Yan－fen1，SHI Hai－lang2，WANG Pei－ying2，QIAO Xiao－qiang2，LIU Zhong－cheng2
（1．Laboratory Management Office，Hebei University，Baoding 071002，China；
2．College of Pharmaceutical Science，Hebei University，Baoding 071002，China）

In order to obtain recombinant Fcε3－4 protein theFcε3－4 gene was amplified by the method of RT－PCR from the total RNA extracted from a fresh spleen of allergic asthma rat，then cloned into expression vector p ET－17b．The Fcε3－4 protein was expressed as inclusion body inE．coliBL21．The denatured Fcε3－4 protein was dissolved in 8 mol／L urea，then purified and refolded in lower urea gradient method on Ni－NAT column．The expressed Fcε3－4 owned the epitope recognised by anti－Fcεantibody through Western Blotting and ELISA analysis，which would be a basis for further studies of the Fcε3－4 protein．

rat；Fcε3－4 gene；clone；expression；immunologic specificity

Q78

A

1000－1565（2012）04－0387－06

2011－12－26

河北省自然科學基金資助項目（C2010000248）；河北省科學技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目（11275530）；河北大學大學生科技創(chuàng)新項目（2011089）

張艷芬（1979－），女，河北邯鄲人，河北大學講師，主要從事分子微生物學研究．

劉中成（1979－），男，河北撫寧人，河北大學副教授，主要從事分子藥理學研究．E－mail：liuzc＠hbu．edu．cn