★ 吳安明 桂嬋 徐蘭 楊小妹 何雁 簡暉 (1.江西天施康中藥股份有限公司 鷹潭5000;.江西中醫(yī)學(xué)院 南昌0004;.深圳市南山區(qū)蛇口人民醫(yī)院 深圳518067)

夏天無為罌粟科植物狀生紫堇Corydalis decumbens(Thunb.)Pers.的干燥塊莖，是江西省著名的民間草藥，具有活血止痛，舒筋活絡(luò)，祛風(fēng)除濕之功效，用于中風(fēng)偏癱，頭痛，跌撲損傷，風(fēng)濕痹痛，腰腿疼痛等［1］，主要含有畢枯枯林(bicuculline，BI)、原阿片堿(protopine，PRO)、延胡索乙素(tetrahydropalmatine，THP)、巴馬汀(palmatine，PAL)等生物堿。藥理實驗表明，夏天無生物堿具有增加心肌營養(yǎng)性流量、擴張外周血管、腦血管和下肢血管、對抗血小板聚集、松弛平滑肌、抑制實驗性血栓形成、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用，近來有研究報道夏天無總生物堿具有抗膽堿酯酶活性［2］。為了提高夏天無的療效，充分發(fā)揮夏天無的療效，我們采用乙醇提取，離子交換樹脂精制得到了夏天無提取物(生物堿類成分含量大于50%)，藥理實驗證明具有較好的鎮(zhèn)痛消炎等作用。本試驗以 BI、PRO、THP、PAL 為指標，對夏天無提取物的基本理化性質(zhì)如表觀溶解度、表觀油水分配系數(shù)、粉體學(xué)性質(zhì)以及在高溫高濕強光照射條件下的穩(wěn)定性進行研究，為夏天無提取物的制劑處方設(shè)計和制備工藝研究提供參考。

1 儀器與材料

美國Agilent 1100高效液相色譜儀(配DAD、低壓四元泵、在線脫氣裝置、自動進樣器、Chemstation工作站)(Agilent科技有限公司);Milli-Q純水處理系統(tǒng)(美國MILLIPORE公司);HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市江南儀器廠);AL104-01電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);PB-10型pH酸度計(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);SHZ-82氣浴恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司);LRH-250-S恒溫恒濕培養(yǎng)箱(廣東醫(yī)療器械廠);LS-2000A低溫恒溫光照儀(上海黃海藥檢所);101-3-BS-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)。

BI、PRO、THP、PAL 對照品(批號分別為 1022-101019、1369-100918、1361-080213、1024-101019，純度＞98%，均購至中藥固體制劑技術(shù)國家工程研究中心);夏天無提取物(自制，含 BI4.68%、PAL2.44%、THP10.45%、PRO38.53%);甲醇(色譜純，上海振興化工一廠);乙腈(色譜純，山東蜀王實驗有限公司);其他試劑均為分析純;配制溶液所用水均為雙重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 夏天無提取物和指標成分在不同介質(zhì)中的表觀油水分配系數(shù)實驗

將蒸餾水與正辛醇混合后室溫攪拌24 h，靜置過夜，分層后得水飽和的正辛醇和正辛醇飽和的水。取適量夏天無提取物粉末溶解于被水飽和的正辛醇中，制成藥物的正辛醇溶液(精密吸取1 mL藥物的正辛醇溶液置恒重坩堝內(nèi)，干燥至恒重，精密稱重，記為m總)。精密吸取上清液5 mL于離心筒中，分別加入正辛醇飽和的水、pH 5、pH 6、pH 7.2、pH 8磷酸鹽緩沖液各30 mL，封口膜封口后，于37℃恒溫振蕩器中振搖48 h，離心(5000 r·min－1，15 min)后取下層水相，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按照文獻方法進行含量測定［3］，計算夏天無提取物4個指標成分的濃度。吸取上層正辛醇液置恒重坩堝內(nèi)，干燥至恒重，精密稱重，記為m正。

精密移取1 mL藥物的正辛醇溶液，氮氣吹干，加10 mL 甲醇，渦旋5 min，離心(5000 r·min－1，10 min)后取上清液過微孔濾膜，取續(xù)濾液注入HPLC，按外標法以峰面積計算夏天無提取物4個指標成分的濃度，即為各成分的初始濃度ρ。

按下列方程式計算BI、PRO、THP和PAL的表觀油水分配系數(shù)(Papp):

ρ為BI、PRO、THP和PAL在正辛醇中的初始濃度(μg·mL－1);υ為被水飽和的正辛醇體積(5 mL);ρw為藥物分配平衡時在水相中測得的 BI、PRO、THP和 PAL的濃度(μg·mL－1);υw 為水相體積(30 mL)。

按下列方程式計算夏天無提取物的表觀油水分配系數(shù)(Papp)。

其中，m總為1 mL藥物的正辛醇溶液干燥恒重后，夏天無提取物的重量(g);m正為樣品中正辛醇層夏天無提取物的重量(g)。

夏天無提取物和4個指標成分在正辛醇-不同介質(zhì)中的logPapp值見表1。由表1可知，除了蒸餾水外，水相介質(zhì)的pH值越大，夏天無提取物和4個指標的成分logPapp值越大，說明介質(zhì)的pH會顯著影響夏天無提取物和4個指標成分的logPapp。在蒸餾水中，提取物和各指標成分的logPapp值大小順序為:BI＞提取物＞THP＞PAL＞PRO，表明BI的脂溶性最好。當(dāng)磷酸鹽緩沖液的pH小于7.2時，THP的logPapp值最大，而pH值為8.0時，BI的logPapp值最大。

表1 夏天無提取物和4個指標成分在不同溶劑中的logPapp

2.2 夏天無提取物和指標成分在不同介質(zhì)中的表觀溶解度實驗

在10 mL離心筒中分別加入9 mL以下介質(zhì):蒸餾水、無水乙醇、pH 5、pH 6、pH 7.2、pH 8 磷酸鹽緩沖液。取過量夏天無提取物加入離心筒中，放置于(37±1)℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中振搖96 h，于24、48、72、96 h 分別取適量上清液 1.5 mL，經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜濾過，精密移取續(xù)濾液1 mL置恒重坩堝內(nèi)，干燥至恒重，精密稱重，記為m總。另外取續(xù)濾液按照上述色譜條件測定各個時間段夏天無提取物中4個指標成分的濃度。另精密移取1 mL pH 5、pH 6、pH 7.2、pH 8空白磷酸鹽緩沖液置恒重坩堝內(nèi)，干燥至恒重，精密稱量，記為m鹽，則提取物的重量等于m總減m鹽。

夏天無提取物和4個指標成分在不同介質(zhì)中的表觀溶解度見表2。樣品振搖96 h后，夏天提取物和4個指標成分的溶解度在不同介質(zhì)中均達到平衡。夏天無提取物和4個指標成分在無水乙醇中的表觀溶解度最大，指標成分溶解度的大小順序為PRO＞BI＞THP＞PAL，但在蒸餾水中的表觀溶解度最小。磷酸緩沖溶液的pH值越大，夏天無提取物和指標成分的表觀溶解度越小。

表2 夏天無提取物和指標成分在不同溶劑中表觀溶解度

2.3 夏天無提取物粉體學(xué)基本性質(zhì)的測定

2.3.1 振實密度的測定 取過100目篩的夏天無提取物粉末適量，精密稱重后轉(zhuǎn)移至10 mL量筒內(nèi)，然后將量筒自10 cm高度處自然下落到墊有泡沫的實驗臺上，直至粉末體積不再變化為止，讀取其容積V1，用量筒中樣品量W1除以最后容積，計算樣品的振實密度，重復(fù)操作6次，取平均值，計算得出夏天無提取物粉末振實密度的平均值為0.84 g/cm3。

2.3.2 堆密度的測定 取過100目篩的夏天無提取物粉末適量，精密稱重后轉(zhuǎn)移至10 mL量筒內(nèi)，不施加任何外力，讀取其容積V2，用量筒中樣品量W2除以最后容積，計算樣品的振實密度，重復(fù)操作6次，取平均值，計算得出夏天無提取物粉末堆密度的平均值為 0.42 g/cm3。

2.3.3 休止角的測定 采用固定漏斗法測量夏天無提取物粉末的休止角:將三個漏斗串聯(lián)并固定于水平放置的坐標紙上1 cm高度處，將已過100目篩的夏天無提取物粉末沿漏斗壁倒入最上的漏斗中，直到坐標紙上形成的粉末圓錐體尖接觸到最下面的漏斗口為止，由坐標紙測出圓錐底部的直徑(2R)，測定其堆高H，根據(jù)tan θ=H/R求出休止角，重復(fù)操作6次，求平均值。結(jié)果測得夏天無提取物粉末的休止角為50.40°。休止角θ＜30°時流動性很好，θ＞45°時流動性差，θ≤40°時可以滿足生產(chǎn)過程中流動性的需求，而本實驗測得的休止角θ＞45°，表明夏天無提取物粉末流動性不佳。

2.4 穩(wěn)定性影響因素試驗

參照2010年中國藥典第二部附錄ⅪⅩC中關(guān)于原料藥穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則對杏香兔耳風(fēng)提取物進行影響因素試驗［3］。

夏天無提取物中4個指標成分在高溫、高濕、強光照射環(huán)境中的含量變化見表3。由表3可知，樣品在高溫、高濕、強光照射條件下放置10天后，夏天無提取物中4個指標成分的含量變化不顯著，說明夏天無提取物對光、濕、熱不敏感。在相對濕度為95%的環(huán)境下，提取物的吸濕率小于0.15%，說明提取物不易吸濕，且提取物粉末的外觀無明顯變化，提示夏天無提取物中4個指標成分的穩(wěn)定性較好。

表3 BI、PRO、THP 和 PAL 在高溫高濕強光照射條件下含量變化(±s，n=3)

表3 BI、PRO、THP 和 PAL 在高溫高濕強光照射條件下含量變化(±s，n=3)

條件 第5天降解殘存百分率/%BI PRO THP PAL高溫 100.6 ±23.41 99.41 ±1.83 97.3 ±2.42 98.34 ±13.64強光 100.84 ±0.86 96.23 ±5.40 95.63 ±2.48 97.42 ±6.53高濕 101.99 ±6.36 97.93 ±4.09 102.27 ±5.74 99.73 ±2.17條件 第10天降解殘存百分率/%BI PRO THP PAL高溫 99.8 ±2.04 100.52 ±0.67 101.7 ±1.16 99.88 ±2.41強光 102.25 ±3.55 98.46 ±6.19 99.34 ±6.45 103.03 ±2.55高濕 102.01 ±2.34 95.81 ±1.58 95.11 ±1.88 102.73 ±4.83

3 討論

夏天無提取物的成分復(fù)雜，限于條件限制，不能對其中成分逐一測定。本實驗測定了夏天無提取物和4個指標成分的表觀溶解度和表觀油水分配系數(shù)。采用重量法測定夏天無提取物在介質(zhì)中的含量，對提取物的表觀溶解度和表觀油水分配系數(shù)有了初步了解，而用HPLC法測定介質(zhì)中4個指標成分的含量，能夠準確測定4個指標成分的表觀溶解度和油水分配系數(shù)。綜合兩者實驗結(jié)果，更有助于了解夏天無提取物的基本性質(zhì)，可為選擇制劑處方與工藝、確定溶出度測定方法、預(yù)測口服吸收行為提供參考。

表觀溶解度結(jié)果表明，夏天無提取物在蒸餾水中幾乎不溶，4個指標成分表觀溶解度的大小為THP＞PAL＞THP＞BI。夏天無提取物和4個指標成分的表觀溶解度隨介質(zhì)pH值的減小而增加，但增加的程度不同，是因為4個指標成分的堿性大小不同，在酸性環(huán)境中可成鹽，溶解度提高。夏天無提取物和4個指標成分在無水乙醇中的表觀溶解度明顯大于水，表明夏天無提取物有一定的親脂性。

細胞膜的類脂性要求藥物只有透過類脂膜才能容易被體內(nèi)吸收，故藥物的脂溶性是藥物吸收重要影響因素，而藥物的脂溶性取決于它本身的分子結(jié)構(gòu)及所處pH條件下的分子型比例［4，5］。表觀溶解度和表觀油水分配系數(shù)結(jié)果表明，夏天無提取物中4個指標成分為弱堿性。當(dāng)pH值較大時，指標成分以游離堿分子型為主，溶解度減小，油水分配系數(shù)增大，即脂溶性提高;當(dāng)pH較小時，指標成分以離子型為主，溶解度增大，油水分配系數(shù)減小，即脂溶性降低，可預(yù)測夏天無提取物的口服吸收與pH值密切相關(guān)。

粉體學(xué)基本性質(zhì)的測定可為制劑的處方工藝設(shè)計提供重要的試驗依據(jù)，流動性會影響粉體的產(chǎn)品質(zhì)量均勻性，堆密度的大小會影響粉體的充填性。試驗研究結(jié)果表明，夏天無提取物粉末休止角為50.40°，振實密度為 0.84 g/cm3，說明夏天無提取物流動性欠佳，堆密度較小，在制劑工藝中可能會出現(xiàn)充填不均勻，重量差異較大等問題，故在處方設(shè)計時，可通過制粒或加入適量的助流劑等方法予以預(yù)防。穩(wěn)定性影響因素試驗表明，高溫、高濕、強光照射對夏天無提取物指標成分的含量變化無顯著影響。因夏天無提取物是經(jīng)離子交換樹脂精致純化后得到，除去了大部分多糖、蛋白類、鞣質(zhì)等易吸潮成分，因此夏天無提取物粉末不易吸潮。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:982.

［2］盛瑞，顧振綸，蔣航，等.夏天無對小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶的影響［J］.中草藥，2003，34(6):543 －545.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄176.

［4］王亞樂，賈曉斌，陳彥，等.淫羊藿苷平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)的測定［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2008，9:779 －780.

［5］王英姿，任天池，孫秀梅.高烏甲素的油水分配系數(shù)及透皮吸收速率常數(shù)的相關(guān)性研究［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，30(2):155－156.