★ 李緒松 鄭臣校 付光明 (廣東省中山市中醫(yī)院 中山528400)

中醫(yī)骨傷科對(duì)骨折的治療遵從于復(fù)位、固定、功能鍛煉和三期辯證用藥的一般原則。強(qiáng)調(diào)“腎藏精，主骨生髓”理論指導(dǎo)下的骨折用藥方法。結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗(yàn)，以及現(xiàn)代藥理對(duì)中藥多糖類的研究進(jìn)展，我們對(duì)菟絲子總多糖進(jìn)行了創(chuàng)新性使用，觀察菟絲子總多糖局部應(yīng)用對(duì)家兔骨折的修復(fù)TGF-β1表達(dá)情況。以說(shuō)明補(bǔ)腎中藥促進(jìn)骨折修復(fù)的可行性和部分內(nèi)涵。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用健康成年家兔63只，體重(2.3±0.3)kg，按性別隨機(jī)分為三組:菟絲子總多糖組(A組)、BMP/明膠復(fù)合物組(B組)以及空白對(duì)照組(C組)。每組21只兔。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與器材

菟絲子總多糖(廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥制劑室提供);人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(human bone morphogenetic protein，rhBMP)(天津中津生物發(fā)展有限公司提供);明膠(成都科龍化工試劑廠生產(chǎn));TGF-β1免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn));DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色液(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn));戊巴比妥鈉(上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站分裝廠進(jìn)口分裝);Leitz wetzlar 1512型石蠟切片機(jī)(德國(guó)生產(chǎn));CK-2型普通光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司生產(chǎn))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的造模

以3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈麻醉成功。家兔取仰臥位，四肢固定于自制兔板上，搬運(yùn)至手術(shù)臺(tái)上。通過(guò)脛腓骨前外側(cè)入路，切口約5～6 cm，逐層切開皮膚、皮下組織及關(guān)節(jié)囊，顯露家兔脛骨。盡量不損傷骨膜。使用線鋸將脛骨截?cái)?，并形成一約0.5 cm的骨缺損區(qū)域。慶大霉素-生理鹽水沖洗后，對(duì)A、B、C三組分別給予中藥菟絲子總多糖、BMP/明膠復(fù)合物以及空白處理。然后逐層縫合骨膜及肌肉、筋膜層以及皮膚切口。術(shù)后傷口外涂紅霉素眼膏，每只動(dòng)物每天肌注青霉素鈉3?105 U，每天一次，共7天。常規(guī)進(jìn)食，分籠飼養(yǎng)，自由活動(dòng)，予以?shī)A板外固定。術(shù)后2、4、8周，沿原手術(shù)切口取下骨折的脛骨，修剪周圍的軟組織，用4%多聚甲醛固定，4℃過(guò)夜，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗，置入20%二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)pH值7.4的磷酸緩沖液中，室溫下脫鈣10天，中間換液一次，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟4 h，軟蠟包埋。切片厚度5 μm，37℃烤片過(guò)夜。行TGF-β1免疫組化;并處死動(dòng)物送標(biāo)本。8周處死所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

2.2 觀察指標(biāo)及測(cè)定方法

應(yīng)用TGF-β1免疫組化的方法，切片經(jīng)二甲苯脫蠟4 h，梯度酒精水化，0.3%過(guò)氧化氫甲醇溶液滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，5%羊血清封閉后，加1∶100稀釋的兔抗鼠TGF-β1抗體，4℃過(guò)夜，復(fù)溫沖洗后加1∶300稀釋的羊抗兔抗體，37℃孵育30 min，沖洗后再加1∶300稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃孵育30 min，沖洗后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，梯度酒精脫水二甲苯透明后封片。觀察各組術(shù)后切片修復(fù)組織的積分光密度值(IOD)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理:計(jì)量資料，以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA);經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)用Homageneity of variance test。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 一般情況

術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物切口均于5～7天愈合，A組1只共1個(gè)骨折端，B組2只共2個(gè)骨折端，C組1只共1個(gè)骨折端術(shù)后2～3天曾出現(xiàn)腫脹積液，給予消毒后穿刺積液抽吸為淡黃色質(zhì)稀液體。

3.2 TGF-β1 免疫組化

免疫組織化學(xué)主要原理是用標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)的抗原進(jìn)行定性、定位和定量檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)是具有高度的特異性、敏感性和精確性。陽(yáng)性結(jié)果時(shí)采用了對(duì)切片修復(fù)組織的積分光密度值(IOD)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。IOD能反映出被測(cè)個(gè)體截面或投影輪廓內(nèi)總的吸光度，由各像素點(diǎn)光密度值直接相加，表示組織細(xì)胞截面或投影輪廓內(nèi)染色的深淺總量。

表1 TGF-β1免疫組化IOD組間比較(±s)

表1 TGF-β1免疫組化IOD組間比較(±s)

與空白組比較:△P ＜0.05，★P ＜0.01。

組別 標(biāo)本數(shù)量 2周 4周 8周A 組 7 59.25 ±12.47★ 84.86 ±22.57★ 76.96 ±19.57★B 組 7 56.67 ±15.43 76.81 ±24.49★ 68.17 ±7.66★C組7 37.48 ±13.54 31.83 ±9.26 27.62 ±8.32

由表1可以看出:2、4、8周時(shí)，中藥組、BMP組TGF-β1免疫組化積分光密度值與空白組比較，都有顯著性差異(P＜0.01或P＜0.05);中藥組與BMP組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示:菟絲子總多糖及BMP/明膠復(fù)合物能夠提高修復(fù)組織的TGF-β1分泌表達(dá)，為骨折修復(fù)組織的生長(zhǎng)、塑形提供基質(zhì)材料。

4 結(jié)論

菟絲子總多糖與空白組比較在2、4、8周均有顯著性差異;與BMP組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)。提示在骨折愈合的不同階段，產(chǎn)生TGF-β1的細(xì)胞是不同的，表達(dá)量也不同，上述變化與組織學(xué)改變密切相關(guān)。而且與相應(yīng)細(xì)胞的功能狀態(tài)密切相關(guān)，這說(shuō)明菟絲子總多糖可促進(jìn)TGF-β1參與調(diào)節(jié)骨折修復(fù)。一定程度證實(shí)了利用補(bǔ)腎中藥菟絲子對(duì)骨折損傷的修復(fù)作用，也符合骨折治療中強(qiáng)調(diào)補(bǔ)肝腎補(bǔ)氣血的用藥原則。

5 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)藥在骨折治療中發(fā)揮著重要作用，其治療原則仍以骨折復(fù)位、固定、功能鍛煉為一般原則，臨床用藥遵從三期辯證用藥。目前大部分報(bào)道集中在復(fù)方制劑對(duì)促進(jìn)骨折愈合的臨床療效觀察和單味中藥有效單體成分實(shí)驗(yàn)觀察階段。隨著分子生物學(xué)、組織工程、基因工程的研究深入，中醫(yī)對(duì)骨折損傷的理論應(yīng)當(dāng)有所針對(duì)性創(chuàng)新，并對(duì)有利于骨折修復(fù)的補(bǔ)腎活血類中藥有效藥用成分以及藥理作用環(huán)節(jié)進(jìn)行明確的研究。有學(xué)者研究表明［1］，TGF-β1表達(dá)量和組織學(xué)分布的變化與骨折愈合過(guò)程中相應(yīng)的組織學(xué)變化密切相關(guān)，而且與相應(yīng)細(xì)胞的功能狀態(tài)相關(guān)，說(shuō)明TGF-β1是調(diào)節(jié)骨折愈合過(guò)程的重要因子以便在骨折修復(fù)修復(fù)領(lǐng)域發(fā)揮更重要的作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究提示菟絲子能夠促進(jìn)造血功能，能促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞的增殖，而髓腔內(nèi)干細(xì)胞同時(shí)包括了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，為菟絲子補(bǔ)腎生髓養(yǎng)骨提供了依據(jù)。王建紅等［2］發(fā)現(xiàn)菟絲子黃酮能下調(diào)心理應(yīng)激大鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)β-EP，上調(diào)腺垂體L H水平?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究［3］表明:菟絲子還能提高免疫功能，清除氧自由基、活性氧及抗脂質(zhì)過(guò)氧化，增強(qiáng)體液免疫功能;具有一定的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)樣作用和類似雌激素樣作用，通過(guò)作用于不同的靶腺軸起到調(diào)節(jié)骨軟骨代謝的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究提示多糖可能是補(bǔ)腎藥藥理作用的重要基礎(chǔ)，目前研究較多的有枸杞多糖、菟絲子總多糖、地黃多糖、黃芪多糖、人參多糖以及六味地黃多糖等復(fù)方多糖。它們的共同功效包括［4］:能提高免疫功能，清除氧自由基、活性氧及抗脂質(zhì)過(guò)氧化等;菟絲子總多糖同時(shí)具有良好的成膜性和凝膠化能力，對(duì)溫度和PH值穩(wěn)定性好，具有生物相容性和生物降解性，水溶性好。通過(guò)制成水凝膠具有定形和緩釋作用，在既往試驗(yàn)中，有學(xué)者［5］觀察到菟絲子總多糖凝膠在骨質(zhì)缺損內(nèi)2～4周內(nèi)完全吸收，與促進(jìn)Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)四周達(dá)峰一致。并且與BMP凝膠組沒(méi)有明顯差異，而且略有優(yōu)勢(shì)，菟絲子總多糖凝膠發(fā)揮了促進(jìn)骨折修復(fù)因素與臨時(shí)基質(zhì)結(jié)合體的作用。

本次實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)菟絲子總多糖的創(chuàng)新性使用，提示可能在骨組織工程中種子細(xì)胞的體外培養(yǎng)以及輔助各種生長(zhǎng)因子實(shí)現(xiàn)增效方面發(fā)揮積極的作用。在骨折愈合的不同階段，TGF-β1是參與調(diào)節(jié)骨折修復(fù)的重要因子。但機(jī)體對(duì)骨折愈合過(guò)程的調(diào)控是復(fù)雜的，單一因子不能解釋其全部?jī)?nèi)容［6］。關(guān)于骨折愈合過(guò)程中應(yīng)用菟絲子總多糖等類似的中藥提取物對(duì)其它相關(guān)因子表達(dá)的影響，以及生長(zhǎng)因子局部應(yīng)用促進(jìn)骨折愈合等問(wèn)題，尚待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)所選菟絲子的多糖成份有很強(qiáng)粘合的作用，既有對(duì)骨折斷端的固定粘接功效，又可促進(jìn)骨折的修復(fù)，具雙重作用，在目前骨折的修復(fù)治療中具有極強(qiáng)的創(chuàng)新性。是對(duì)中藥利用傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)結(jié)合現(xiàn)代藥理、病理進(jìn)展提示做出的一次大膽嘗試，對(duì)我們?nèi)蘸笱芯恐嗅t(yī)理論、開發(fā)新藥提出了更廣闊的道路。有利于拓展中藥的使用范圍，增加新的給藥途徑和提高臨床療效，從而提高中醫(yī)藥的競(jìng)爭(zhēng)力，更好的為人類健康謀福利。

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