胡 婭，蹇順華，向 楠

（1.長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 430023；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種由多種原因引起的全身性骨骼疾病，它以骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化，骨量減少為主要特征，導(dǎo)致骨的脆性增加而容易發(fā)生骨折［1］。臨床上主要表現(xiàn)為腰背肢體疼痛，病理骨折，身體畸形，或伴有原發(fā)疾病表現(xiàn)。本病屬于中老年人的一種退行性病變，發(fā)病率高，嚴(yán)重危害中老年健康，已成為老齡化社會(huì)衛(wèi)生保健的突出問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)去卵巢（OVX）骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGFβ1）的表達(dá)水平，探究補(bǔ)腎化痰方的成骨機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8 月齡雌性SD 大鼠，清潔級(jí)，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供，許可證號(hào)SCXK（鄂）2004-0007。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 補(bǔ)腎化痰方由菟絲子30 g，淫羊藿10 g，補(bǔ)骨脂15 g，全瓜蔞15 g，紅曲12 g 和生山楂20 g 組成，生藥由湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診部中藥房提供，加水煎煮，過(guò)濾，并濃縮，配制成0.94 g/mL 和1.88 g/mL 兩個(gè)濃度的生藥混懸液，密封貯存于4 ℃冰箱備用。利維愛(ài)（南京歐加農(nóng)制藥有限公司，2.5 mg/片，批號(hào)：LK-4305-10）。

1.1.3 試劑與儀器 兩步法抗兔免疫組化試劑盒（DAKO 公司，貨號(hào)：K5007），骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：bs-1012R），轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1抗體（美國(guó)santa cruz 公司，貨號(hào)：sc-146）。JT-12J 電腦生物組織脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；KD-BM 生物組織包埋機(jī)（浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 去卵巢大鼠模型的建立和分組 50 只大鼠隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組、西藥組、中藥低劑量組、中藥高劑量組。除對(duì)照組外，其他各組大鼠行卵巢切除術(shù)。麻醉后，無(wú)菌條件下行背部肋下雙側(cè)卵巢切除。假手術(shù)組術(shù)式相同，但不摘除卵巢，僅切除少量卵巢周圍脂肪組織。術(shù)后3 個(gè)月開(kāi)始灌胃給藥，中藥組以補(bǔ)腎化痰方灌胃，低劑量組9.4 g，高劑量組18.8 g；西藥組予以利維愛(ài)0.23 mg，對(duì)照組、假手術(shù)組予以等體積的生理鹽水灌胃，每天1 次，給藥時(shí)間為8 w。期間各組大鼠分籠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。

1.2.2 骨組織形態(tài)學(xué)觀察及BMP-2 和TGF-β1測(cè)定 取大鼠的左側(cè)脛骨骨組織，剔除周圍附著的肌肉等軟組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h，再于10%硝酸溶液中脫鈣處理。常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色。顯微鏡下觀察骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，免疫組化檢測(cè)骨組織BMP-2 和TGF-β1水平。結(jié)果采用Image pro-plus 6.0 圖像分析方法進(jìn)行分析。每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選3～5 個(gè)400 倍視野進(jìn)行拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)每張照片進(jìn)行分析，得出每張照片的累積光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎化痰方對(duì)OVX 大鼠骨組織形態(tài)學(xué)變化的影響

假手術(shù)組骨小梁粗大，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，分布均勻，排列規(guī)則，骨小梁未見(jiàn)中斷，骨小梁之間的間隙??；模型組與假手術(shù)組相比，骨小梁明顯顯得纖細(xì)，形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整，分布稀疏零亂，斷裂嚴(yán)重，骨小梁間間距較大，出現(xiàn)典型的骨質(zhì)疏松病理形態(tài)改變；西藥組骨小梁數(shù)量較多，結(jié)構(gòu)完整，排列較整齊，骨小梁未見(jiàn)明顯中斷，小梁間間隙較小，骨小梁的數(shù)量、寬度、完整性明顯優(yōu)于模型組，但比假手術(shù)組稍差；中藥低劑量組骨小梁可見(jiàn)部分?jǐn)嗔?，骨小梁連接點(diǎn)減少，形態(tài)結(jié)構(gòu)欠完整，排列不規(guī)則，骨小梁間間距增大，骨小梁的數(shù)量、寬度、完整性優(yōu)于模型組，但不如中藥高劑量組、西藥組和假手術(shù)組；中藥高劑量組骨小梁數(shù)量較多，排列規(guī)則，少許骨小梁可見(jiàn)扭曲和斷裂，但尚可聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，骨小梁間間距稍大，骨小梁的數(shù)量、寬度、完整性優(yōu)于模型組和中藥低劑量組，但不如西藥組和假手術(shù)組。

2.2 補(bǔ)腎化痰方對(duì)OVX 大鼠骨組織BMP-2 和TGFβ1的影響

BMP-2 和TGF-β1表達(dá)主要分布在定位于骨小梁附近的成骨細(xì)胞，在成骨細(xì)胞的胞漿中呈陽(yáng)性顯色。光鏡下觀察，模型組成骨細(xì)胞中的BMP-2 和TGF-β1表達(dá)的陽(yáng)性顆粒均呈淡黃色，在胞漿內(nèi)均勻分布，其他各組的陽(yáng)性表達(dá)顆粒明顯增多，呈棕黃色密集分布于成骨細(xì)胞的胞漿內(nèi)。各組BMP-2 陽(yáng)性表達(dá)：假手術(shù)組、西藥組、中藥低劑量組、中藥高劑量組累積光密度值明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中藥低劑量組陽(yáng)性表達(dá)低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)：與模型組相比，假手術(shù)組、西藥組、中藥低劑量組、中藥高劑量組累積光密度值均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠骨組織BMP-2、TGF-β1表達(dá)的累積光密度值 （±s）

表1 各組大鼠骨組織BMP-2、TGF-β1表達(dá)的累積光密度值 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.01；與假手術(shù)組比較，2）P＜0.05

3 討論

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）是一個(gè)生長(zhǎng)分化因子家族，參與骨與軟骨的形態(tài)發(fā)生過(guò)程。BMP-2 是BMPs 中活性最強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)因子，具有強(qiáng)大的骨、軟骨誘導(dǎo)活性，可以有效地促進(jìn)骨折的愈合和骨缺損的修復(fù)［2］。研究證明，不表達(dá)BMP-2 的成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞不具備分化能力，但是如果對(duì)這種前體細(xì)胞加入外源重組BMP-2 或?qū)MP-2 基因?qū)氪思?xì)胞，便可促使其分化，表明成骨細(xì)胞的分化與BMP-2 基因表達(dá)密切相關(guān)。當(dāng)BMP-2 表達(dá)下降時(shí)，骨髓中許多具有成骨誘導(dǎo)潛能的干細(xì)胞，增殖分裂明顯減少，從而使成骨細(xì)胞功能減退，導(dǎo)致骨小梁減少，骨形成量減少，造成骨質(zhì)疏松。當(dāng)BMP-2 表達(dá)增強(qiáng)時(shí)，成骨細(xì)胞自分泌與旁分泌BMP-2 增加，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)鈣化，促進(jìn)骨組織的生長(zhǎng)發(fā)育，維持骨代謝的平衡。BMP-2 既能直接促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖，又能促進(jìn)其他成骨因子的表達(dá)，多方面促進(jìn)骨形成［3］。

骨組織已發(fā)現(xiàn)的TGF-β 三種亞型中，以TGFβ1含量最為豐富。TGF-β1維持骨形成和骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡，是骨代謝環(huán)境中的重要影響因子之一［4］。一方面，TGF-β1可以通過(guò)抑制破骨細(xì)胞生成以及抑制成熟破骨細(xì)胞的活性來(lái)抑制骨吸收作用，從而防治骨質(zhì)疏松；另一方面，TGF-β1通過(guò)刺激成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)骨和軟骨細(xì)胞膠原及基質(zhì)蛋白的合成與鈣化，通過(guò)刺激或抑制其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生或調(diào)控其作用，來(lái)調(diào)節(jié)骨代謝，從而促進(jìn)骨形成。TGF-β1既影響成骨細(xì)胞活性又影響破骨細(xì)胞活性，是骨吸收與骨形成之間有力的調(diào)節(jié)和偶聯(lián)因子。

骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)“骨痿”、“骨痹”、“腰痛”、“骨枯”、“骨極”的范疇，補(bǔ)腎法歷來(lái)被作為治療腎虛骨質(zhì)疏松癥的主要療法。研究證實(shí)補(bǔ)腎中藥能促進(jìn)骨形成［5］，使OVX 骨質(zhì)疏松模型大鼠產(chǎn)生較多的骨基質(zhì)，使類骨質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榈V化骨小梁。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明補(bǔ)腎化痰方能增加OVX 大鼠骨密度［6］，本實(shí)驗(yàn)提示補(bǔ)腎化痰方通過(guò)增強(qiáng)BMP-2、TGF-β1表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的平衡，改善骨密度。

［1］劉忠厚，楊定焯，朱漢民，等.中國(guó)人原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，1995，5（1）：1-3.

［2］張宏宇，趙彬，張麗彥，等.辛伐他汀對(duì)糖尿病大鼠種植體周圍骨組織中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 表達(dá)影響的研究［J］.中國(guó)實(shí)用口腔科雜志，2011，4（1）：28-30.

［3］Vaes B L，Deehering K J，F(xiàn)eijen A，et al.Comprehensive microarray analysis of bone morphogenetic protein 2 induced osteoblast differentiation resulting in the identification of novel markers for bone development［J］.J Bone Miner Res，2002，17（12）：2 106-2 118.

［4］舒曉春，朱丹華，魯紅云，等.骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中TGF-β1、BMP-2 分泌的影響［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2010，26（11）：990-992.

［5］潘偉軍，曾昭明，黃宏興.補(bǔ)腎益精法治療更年期婦女骨質(zhì)疏松的臨床觀察［J］.山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，7（4）：30-31.

［6］胡婭，向楠，蹇順華，等.補(bǔ)腎化痰方對(duì)去卵巢大鼠血清ADP 和TRACP5b 的影響［J］.吉林中醫(yī)藥，2010，30（12）：1 101-1 102.