薛偉善

(遼寧師范大學(xué)體育學(xué)院，遼寧大連 116029)

不同運(yùn)動(dòng)時(shí)間對2型糖尿病大鼠骨骼肌Glut－4含量變化的研究

薛偉善

(遼寧師范大學(xué)體育學(xué)院，遼寧大連 116029)

為了解運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度相同而運(yùn)動(dòng)時(shí)間不同對鼠肌葡萄糖載體－4(Glut－4)蛋白表達(dá)及含量的影響，采用制備糖尿病大鼠模型方法將SD大鼠分為正常對照組、糖尿病對照組、糖尿病運(yùn)動(dòng)組(20min組、40min組、60min組和80min組)等6組，以20m/min的強(qiáng)度進(jìn)行8周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，用Western blot免疫印跡法檢測運(yùn)動(dòng)后GLUT－4蛋白含量。結(jié)果表明，與糖尿病對照組相比，運(yùn)動(dòng)時(shí)間20min、40min組、60min組和80min組的股四頭肌Glut－4蛋白含量顯著升高(P＜0.01);與20min組相比，運(yùn)動(dòng)時(shí)間40min組、60min組及80min組的Glut－4蛋白含量顯著升高(P＜0.01)，認(rèn)為運(yùn)動(dòng)時(shí)間對Glut－4蛋白含量產(chǎn)生明顯的影響，運(yùn)動(dòng)時(shí)間達(dá)40min以上可能具有更好的效果。

不同運(yùn)動(dòng)時(shí)間;2型糖尿病大鼠;Glut－4含量

－4(Glut－4)蛋白含量降低和活動(dòng)異常是主要原因［1］。以往的研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)可提高骨骼肌細(xì)胞膜Glut－4蛋白的含量［2－3］，有助于Glut－4在骨骼肌細(xì)胞細(xì)胞膜上的易位，加快葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的速度。以往的研究雖然觀察了運(yùn)動(dòng)對

Glut－4含量的影響，但這些研究均沒有深入研究不同時(shí)間運(yùn)動(dòng)的影響。運(yùn)動(dòng)時(shí)間在運(yùn)動(dòng)處方構(gòu)成的諸要素中尤為重要，機(jī)體對不同的運(yùn)動(dòng)時(shí)間產(chǎn)生不同的應(yīng)答。糖尿病患者在進(jìn)行康復(fù)鍛煉時(shí)，有關(guān)Glut－4蛋白的表達(dá)及含量隨不同運(yùn)動(dòng)時(shí)間的變化而改變的規(guī)律還不很清楚，系統(tǒng)的研究更少見。由于不清楚不同時(shí)間的運(yùn)動(dòng)對Glut－4蛋白的影響，因此在實(shí)踐指導(dǎo)時(shí)就缺乏科學(xué)的理論依據(jù)，使2型糖尿病患者在進(jìn)行運(yùn)動(dòng)康復(fù)鍛煉時(shí)就具有一定的盲目性。因而開展此領(lǐng)域的研究，則具有重要的理論和實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

選用70只健康SD(Sprague－Dawley)大鼠(不分雌雄，體質(zhì)量為200g±14g)，SD大鼠由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供。在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下分籠喂養(yǎng)，自由攝取水和食物，在喂養(yǎng)1周后進(jìn)行適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)分組為正常對照組(NC)10只，實(shí)驗(yàn)組60只，均隨機(jī)選取。

1.1.1 制備2型糖尿病模型 2型糖尿病大鼠模型的制備參照洪麗莉等的實(shí)驗(yàn)［4］。方法是喂食4周的自備高糖高脂飼料，并在飲水中添加濃度3%的果糖。同時(shí)按30mg/kg體重的劑量一次性腹腔內(nèi)注射 STZ的混合制劑:pH4.4，0.1mmol/L檸檬酸緩沖液。在注射1周后，測試大鼠葡萄糖耐量。具體方法是大鼠禁食4～6小時(shí)，腹腔注射葡萄糖(按2g/kg體重的標(biāo)準(zhǔn))，斷尾采血，分別測定0、60和120min血糖的動(dòng)態(tài)變化，糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)為:空腹血糖連續(xù)2次高于等于 7.8mmol/L、或葡萄糖負(fù)荷后 2h血糖高于等于11.1mmol/L［5］。本實(shí)驗(yàn)造模的成功率可達(dá)85%。將符合標(biāo)準(zhǔn)的50只大鼠隨機(jī)分為糖尿病對照組、20min、40mi、60min及80min運(yùn)動(dòng)組，并繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。2周后(大鼠禁食12h后)斷尾取血測空腹血糖及胰島素值。高糖高脂飼料配方:100kg飼料中添加人全蛋粉6kg、蔗糖23kg、煉豬油26.5kg，混和成形，其總熱量為20.103J/g，其中蛋白質(zhì)占15%，碳水化合物占50%，脂肪占25%。

1.1.2 制定運(yùn)動(dòng)模型 參照Soya等的實(shí)驗(yàn)［6］，本實(shí)驗(yàn)選20m/min強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)為負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行時(shí)間為8周，方式為跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，實(shí)驗(yàn)組分為:20min組、40min組、60min組和80min組。對照組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置，符合有關(guān)的國際動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)由R＆D Systems公司提供GLUT－4多克隆抗體、由英國Amersham公司提供ECL、New England BioLabs預(yù)染蛋白Marker、國強(qiáng)生公司提供快速血糖儀及試紙。胰島素的測定采用放射免疫法，由南京生物工程研究所提供試劑盒。由北京福瑞生物工程公司提供甘油三酯和總膽固醇試劑盒。由北京碩林苑科技有限公司提供動(dòng)物跑臺(tái)，大鼠跑臺(tái)型號(hào)為SLY－RTML。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 收集標(biāo)本 8周后，最后一次運(yùn)動(dòng)24h后，按50mg/ kg的標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，提取后肢股四頭肌肉組織并置于液氮中冷凍。

1.2.2 制備股四頭肌肌細(xì)胞膜 肌膜的制備參照Huisman等人的實(shí)驗(yàn)［7］。取100g股四頭肌肌肉組織，冰上剪碎并加入裂解液［Tris－HCL20mol·L－1(pH7.5)，蔗糖330mol· L－1，EDTA 0.5mol·L－1，PMSF 1mol·L－1，Lepetin25mg· L－1］。離心機(jī)上1000r·min－1的標(biāo)準(zhǔn)離心10min。取上清液并以40000r·min－1的標(biāo)準(zhǔn)冷凍超速離心1h并棄上清。在所得沉淀中，再次加入裂解液，用超聲裂解的方法循環(huán)7次萃取，再以40000r·min－1的標(biāo)準(zhǔn)冷凍高速離心1h所得上清即是細(xì)胞膜組織。蛋白濃度的測定采用改良 Lowry法［8］。GLUT－4蛋白含量的測定采用Western blot免疫印跡法，取股四頭肌肌細(xì)胞膜樣品50μg先進(jìn)行SDS－PAGE蛋白分離，然后將蛋白電轉(zhuǎn)移至NC(硝酸纖維素)膜上，再用奶粉(5%脫脂)TBS封閉，控制溫度4°C并過夜。室溫加抗Glut－4單克隆抗體1h，洗膜后，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗1h，與ECL反應(yīng)1min后即刻與X光片曝光并洗片，用圖像分析儀掃描(德國產(chǎn)Leica Q550－IW)，計(jì)算光密度并進(jìn)行定量分析。以正常對照組的Glut－4蛋白含量為100計(jì)算其他各組的相對含量。

1.2.3 數(shù)理統(tǒng)計(jì)法 對所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析。顯著性水平為0.05。統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 15.0。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與對照組相比，在糖尿病建模后，反應(yīng)2型糖尿病特征的指標(biāo)如體重、血清甘油三酯、總膽固醇、血糖和胰島素水平明顯升高(P＜0.01)。

表1 造模成功后兩組體重、血糖、血脂和胰島素水平的變化

對照組大鼠比，糖尿病對照組肌膜Glut－4蛋白含量明顯下降(P＜0.01)。與糖尿病對照組大鼠比，20min、40mmin、60min和80min組股四頭肌Glut－4蛋白含量顯著升高(P＜0.01)。與20min組相比，運(yùn)動(dòng)時(shí)間40min、60min及80min組GLUT－4蛋白含量顯著升高(P＜0.01)。運(yùn)動(dòng)時(shí)間達(dá)40min后，隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的增加，Glut－4的含量不再隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的增加而增加。

表2 不同運(yùn)動(dòng)時(shí)間對GLUT－4蛋白含量及磷酸化的影響

3 分析與討論

葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是以易化擴(kuò)散方式實(shí)現(xiàn)的、并由位于細(xì)胞膜上的葡萄糖載體介導(dǎo)的。目前已發(fā)現(xiàn)有6種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它們分別被命名為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1－5，以及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白7［9］。Glut－4是一種由509個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，(分子量約48000)。在靜息狀態(tài)下絕大部分Glut－4位于細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞器上［10］，主要分布在微粒體、高爾基體和肌絲網(wǎng)等重要細(xì)胞器的膜上［11］。也有學(xué)者認(rèn)為在細(xì)胞內(nèi)，存在對胰島素敏感的、富含Glut－4的特異性囊泡樣膜結(jié)構(gòu)。在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族中Glut－4蛋白主要分布在肌肉和脂肪組織中其中小部分Glut－4位于細(xì)胞膜上。目前研究認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)和胰島素是刺激骨骼肌Glut－4轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的兩個(gè)最重要因素。目前對這兩個(gè)因素對Glut－4的轉(zhuǎn)位是否具有同樣的效力，學(xué)術(shù)界仍存在很大的爭議和分歧。但是，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)都已證實(shí)，運(yùn)動(dòng)和胰島素是通過不同的信號(hào)途徑誘發(fā)GLUT－4發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖作用的，其中胰島素是主要通過PI3K(磷脂酰肌醇－3－激酶)途徑，而運(yùn)動(dòng)認(rèn)為主要與AMPK(激活絲裂原活化蛋白激酶)的活動(dòng)有關(guān)。

依據(jù)Soya的大鼠跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)，20m/min相當(dāng)于LT(Lactate Threshold)強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，15m/min為低于LT強(qiáng)度(Sub－LT)的運(yùn)動(dòng)，而25m/min和30m/min為高于LT強(qiáng)度(Supra－LT)的運(yùn)動(dòng)。LT為代謝的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，是有氧代謝向無氧代謝轉(zhuǎn)換的臨界點(diǎn)，其運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度相當(dāng)血乳酸濃度4mmol/L，當(dāng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度高與LT時(shí)機(jī)體的代謝方式開始轉(zhuǎn)向無氧。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過8周不同運(yùn)動(dòng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)組血糖和胰島素均產(chǎn)生良好的改變，與其他學(xué)者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同［12］。本研究顯示，經(jīng)過8周運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌Glut－4含量均有顯著增加，但當(dāng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間達(dá)到40min以上后與20min組相比，效果最好。以前的實(shí)驗(yàn)顯示運(yùn)動(dòng)能更多地促進(jìn)GLUT－4 mRNA的表達(dá)［13］，Dela等的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)能明顯提高Glut－4含量［14］。本研究也顯示，運(yùn)動(dòng)時(shí)間可對Glut－4的含量產(chǎn)生顯著影響，隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長，Glut－4的含量逐漸增加，但當(dāng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間達(dá)到40min以上后，Glut－4的含量達(dá)到峰值，不再隨運(yùn)動(dòng)時(shí)間的增加而增加。提示，在2型糖尿病的康復(fù)鍛煉中，運(yùn)動(dòng)時(shí)間要有個(gè)時(shí)域，為了更好地促進(jìn)血糖的有效利用和提高機(jī)體的糖代謝水平，在適當(dāng)?shù)卮_定運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的基礎(chǔ)上，將運(yùn)動(dòng)時(shí)間控制在40min以上可能對2型糖尿病患者的康復(fù)更加有利。

綜上，2型糖尿病動(dòng)物模型進(jìn)行20m/min強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，在不同運(yùn)動(dòng)時(shí)間影響下，骨骼肌Glut－4含量均增加，但運(yùn)動(dòng)時(shí)間達(dá)到40min后，Glut－4含量增加的效果更好。

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Effects of Different Times’Exercise on Glut-4 Content in Skeletal Muscle of Type 2 DM Rats

XUE Weishan
(Physical Education Institute of Liaoning Normal University，Dalian 116029，Liaoning，China)

Objective:To explore the effects of different times’exercise on GLUT-4 protein content in type 2 DM rats．Method:Sixty SD rats were divided into six groups:normal control group(NC)、diabetes mellitus group(DMC)and 20min、40min、60min and 80min exercise group．The exercise groups did exercise for 8 weeks．The contents of GLUT-4 protein were measured by Western bolt analysis．Result:The contents of IRS-2 protein in 20min，40min，60m/min and 80min group enhanced(P＜0．01)respectively compare with the DMC group，and 40min，60min and 80min group enhanced (P＜0．01)compare with 20min group．Conclusion:The results showed that the exercise times have affected the contents of GLUT-4 protein，exercise times over 40min may have the better effect．

different times’exercise;type 2 diabetic rat;GLUT-4content 2型糖尿病明顯的特征是血液葡萄糖升高，但外周組織細(xì)胞攝取葡萄糖卻存在障礙，研究證實(shí)細(xì)胞膜上葡萄糖載體

G805.52

A

1004－0560(2012)04－0083－03

2012-05-06;

2012-06-15

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30970348)。

薛偉善(1958－)，男，副教授，主要研究方向?yàn)轶w育教學(xué)與運(yùn)動(dòng)健康促進(jìn)。

責(zé)任編輯:喬艷春

?運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)