李 娜，陳 方，歐 倫，孫 效，2，鄒 佳，董立厚，王清清，宋海峰

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850;2.總后勤部豐臺綜合倉庫藥材供應(yīng)站，北京 100071)

粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，GCSF)可以通過影響造血干/祖細胞和骨髓微環(huán)境、細胞凋亡等方面［1］，特異性刺激和調(diào)節(jié)粒系祖細胞的增殖和分化，最終促進中性粒細胞的成熟和釋放。利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的人重組GCSF(rhGCSF)是防治腫瘤放化療引起的中性粒細胞減少癥的有效藥物，臨床應(yīng)用近20年，已經(jīng)取得很多經(jīng)驗［2－3］。rhGCSF可以使患者更好耐受高劑量強度或劑量密集性化療，擴大治療患者的范圍［4］，還用于高劑量化療聯(lián)合自體造血干細胞移植的干細胞動員與移植后造血功能重建［5］;另外，rhGCSF也可用于治療骨髓發(fā)育不良、獲得性免疫缺陷綜合征、粒細胞產(chǎn)生遺傳性障礙等疾病所引起的中性粒細胞減少癥［6］。但是，rhGCSF半衰期短、需頻繁給藥等問題給臨床應(yīng)用帶來不便。目前，雖然國內(nèi)已有多種長效形式的GCSF藥物正處于研發(fā)階段［7］，但距臨床應(yīng)用尚有時日。

本研究的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)rhGCSF(PEG-rhGCSF)是將重組粒細胞集落刺激因子用20 ku的PEG分子修飾后獲得的一種安全、長效的新型制劑。為了更接近臨床患者治療的實際情況，得到更可靠的數(shù)據(jù)，本研究選擇了靈長類動物進行實驗，并且建立了獼猴輻射致造血損傷模型，模擬了臨床放化療所致的粒細胞減少癥，重點觀察PEG-rhGCSF對模型獼猴粒細胞減少癥的治療作用，為之后的臨床研究提供有效的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

PEG-rhGCSF(批號200704Z01)及 rhGCSF(批號200704G01)，均由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供。硫酸慶大霉素注射液購于天津藥業(yè)焦作有限公司，注射用青霉素鈉購于石家莊制藥集團有限公司;注射用頭孢他啶購于海南國瑞堂制藥有限公司，注射用頭孢噻肟鈉購于國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司。

pocH-100iV Diff血細胞計數(shù)儀為日本Sysnex公司產(chǎn)品;BX-40型顯微鏡為Olympus產(chǎn)品。

1.2 動物、照射及分組

動物隨機分成5組:照射模型組(n=6)，PEG-rhGCSF 30，100 和 300 μg·kg－1組(n=5)，rhGCSF 10 μg·kg－1組(n=5)。

獼猴于照射后24 h開始給藥，均采用sc給藥方式。PEG-rhGCSF各劑量組均給藥1次;rhGCSF對照組每天給藥1次，連續(xù)10 d，給藥總量與PEG-rhGCSF 100 μg·kg－1組相同;照射模型組給予相同體積的生理鹽水。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 臨床表現(xiàn)

每日2次觀察動物的活動狀態(tài)、食欲、糞便、體溫和體表皮膚出血或感染灶。動物體溫≥39.5℃或白細胞計數(shù)(white blood cell count，WBC)≤2×109L－1時，給予抗生素支持。

1.3.2 外周血象檢查

動物照射造模當(dāng)天記為第0天，照射后24 h開始給藥，給藥當(dāng)天記為第1天。觀察期間第1～第10天內(nèi)每天采集血樣1次，第10～第49天內(nèi)每2 d采集血樣1次。采用pocH-100iV Diff血細胞計數(shù)儀檢查外周血象，檢測抗凝全血樣品中的WBC、絕對中性粒細胞計數(shù)(absolute neutrophil count，ANC)、紅細胞計數(shù)(RBC)、血小板計數(shù)(platelet count，PLT)。當(dāng)模型動物 ANC≤2.0×109L－1時可診斷為粒細胞減少癥。

1.3.3 骨髓象檢查

每組各取2只動物于照射后15 d行骨髓穿刺，取骨髓液制作涂片，并用Wright-Giemsa染色后，進行各型骨髓系細胞計數(shù)，觀察骨髓象的變化情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

照射模型組動物在照射24 h后，有4只動物出現(xiàn)腹瀉，其中2只排黏液便，1只動物WBC明顯減低。2～10 d時，所有動物均出現(xiàn)食欲下降，嚴(yán)重者開始拒食，伴有不同程度持續(xù)腹瀉和發(fā)熱，同時止血時間明顯延長，有3只動物WBC持續(xù)減低、PLT在9 d左右出現(xiàn)明顯減低。該組動物在po給予十六角蒙脫石 3 g·d－1、im 給予酚磺乙胺 0.25 g·d－1、iv 給予青霉素鈉80 kU·d－1輔助藥物后，腹瀉和出血的癥狀有所緩解，但精神狀態(tài)仍不佳。

PEG-rhGCSF 30 μg·kg－1組有 1 只動物于照射后第4～第7天期間出現(xiàn)發(fā)熱，1只動物WBC減低。PEG-rhGCSF 100 μg·kg－1組動物生理狀態(tài)較好，未出現(xiàn)食量下降的現(xiàn)象，動物體溫也未出現(xiàn)持續(xù)升高，照射后2 d，僅有1只動物出現(xiàn)腹瀉。PEG-rhGCSF 300μg·kg－1組在照射后第1～第3天期間有3只動物腹瀉，但均未出現(xiàn)發(fā)熱現(xiàn)象。腹瀉個體在po給予十六角蒙脫石3 g后，第1～第3天腹瀉癥狀均停止。rhGCSF組動物照射后1 d有2只出現(xiàn)腹瀉、嘔吐現(xiàn)象，2 d時，有1只動物拒食、萎靡，至第10天時仍有2只動物持續(xù)發(fā)熱。

觀察期結(jié)束時(第49天)所有動物均未死亡，除照射模型組外，其他給藥組動物的體重均略有增加，但無統(tǒng)計學(xué)差異(數(shù)據(jù)略)。

2.2 PEG-rhGCSF對輻射致粒細胞減少癥獼猴外周血ANC及WBC的影響

照射后，全部獼猴外周WBC迅速降至初始值(6.5 ×109L－1～12.5 ×109L－1)的 15% ～25%，ANC 降至初始值(4.5×109L－1～8.5 ×109L－1)的12%～20%，照射模型組符合中度骨髓型造血損傷判斷標(biāo)準(zhǔn)［8］。

給藥后，各組獼猴外周血ANC的變化結(jié)果見表1。ANC變化趨勢(表2)與實驗組WBC(表3)基本一致。獼猴接受照射后第2天(即給藥后第1天)，照射模型組ANC迅速下降，而rhGCSF與PEG-rhGCSF組的外周血ANC及WBC則開始升高:PEG-rhGCSF各組均出現(xiàn)一過性的ANC升高峰，且峰值與劑量呈正相關(guān);rhGCSF組ANC緩慢升高，到第7天左右達峰水平，峰值也低于等劑量的PEG-rhGCSF組。照射模型組、rhGCSF組及 PEG-rhGCSF各劑量組的ANC分別于20 d，18 d，24 d左右時下降至谷值;與前兩組相比，PEG-rhGCSF各劑量組的ANC谷值均有提高。

各給藥組照射后粒細胞減少癥持續(xù)時間明顯短于照射模型組，尤其是 PEG-rhGCSF 300 μg·kg－1組(P ＜0.01)。PEG-rhGCSF 30，100 和 300 μg·kg－1組及rhGCSF組的抗生素需求平均天數(shù)與照射模型組相比有顯著差異，分別為(3.2±2.9)d(P＜0.05)，(1.4 ±1.9)d(P ＜ 0.01)，(0.2 ± 0.4)d(P ＜0.01)和(1.6 ±2.1)d(P ＜0.01)(表2)。

雖然rhGCSF組在連續(xù)注射期間，ANC一直處于較高水平，但停藥后迅速降低;至停藥后2 d(即rhGCSF初次給藥后第12天)，ANC已經(jīng)低于相同給藥量的 PEG-rhGCSF 100 μg·kg－1組。PEG-rhGCSF 100μg·kg－1單次注射即與rhGCSF連續(xù)注射的藥效行為相近，而 PEG-rhGCSF 300 μg·kg－1的治療作用則明顯優(yōu)于rhGCSF。PEG-rhGCSF對RBC及PLT數(shù)影響不明顯(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.3 PEG-rhGCSF對輻射致粒細胞減少癥獼猴骨髓象的影響

骨髓涂片結(jié)果顯示，rhGCSF組及PEG-rhGCSF 100和300 μg·kg－1組均可見骨髓增生活躍(見圖1)，主要是粒系細胞的增殖分化增加;PEG-rhGCSF 30μg·kg－1組較照射模型組增生活躍。rhGCSF組粒紅比值為2.00∶1，PEG-rhGCSF 300，100 和 30 μg·kg－1組分別為2.65∶1，1.98∶1和1.91∶1，照射模型組為0.45∶1。

Tab.1 Effect of polyethylene glycolated recombinant human granulocyte colony stimulating factor(PEG-rhGCSF)on peripheral blood absolute neutrophil count(ANC)in rhesus monkeys with radiation-induced neutropenia

Tab.2 Neutrophil-related parameters in 60 Co-γ irradiated rhesus monkeys treated with PEG-rhGCSF

Tab.3 Effect of PEG-rhGCSF on peripheral blood WBC in rhesus monkeys with radiation-induced neutropenia

Fig.1 Effect of PEG-rhGCSF on bone marrow smear from rhesus monkeys with radiation-induced neutropenia(Wright-Giemsa ×40).See Tab.1 for the legend.A:model group;B:PEG-rhGCSF 100 μg·kg－1 group;C:rhGCSF 10 μg·kg－1 group.

3 討論

近年來，rhGCSF類長效藥物的研發(fā)備受關(guān)注。長效藥物修飾技術(shù)主要有以下兩種策略:第一種是利用血漿半衰期長的蛋白，如白蛋白，IgG或轉(zhuǎn)鐵蛋白的 Fc段等作為治療性蛋白的載體［9－10］;第2種是PEG化修飾技術(shù)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用并取得了許多成功經(jīng)驗［11］。其中，利用 PEG修飾技術(shù)研制的Neulasta作為國內(nèi)外唯一上市的長效rhGCSF藥物，療效明確且耐受性良好，但是高劑量需求使其在臨床使用時費用昂貴。

本文研究的PEG-rhGCSF是我國自主研發(fā)的一種新型rhGCSF類長效制劑，PEG修飾后的藥物很大程度上減少了腎清除、細胞攝取和蛋白水解，使藥物在體內(nèi)的循環(huán)半衰期大大高于修飾前的蛋白，PEG-rhGCSF消除的主要途徑僅為粒細胞受體介導(dǎo)的清除［12］。本實驗室曾研究過 PEG-rhGCSF在正常獼猴體內(nèi)的藥代動力學(xué)行為及藥效作用，發(fā)現(xiàn)當(dāng)粒細胞處于正常水平時，粒細胞表面的受體會使PEG-rhGCSF的消除顯著加快，影響PEG-rhGCSF在體內(nèi)真實的藥動和藥效行為?；诖它c，我們在獼猴體內(nèi)建立了造血系統(tǒng)損傷模型，使體內(nèi)粒細胞處于一個較低水平，不足以影響到藥物真實的藥動學(xué)及藥效行為;另外，盡可能準(zhǔn)確研究其在臨床惡性腫瘤患者接受放療或化療后所致造血功能損傷引起的粒細胞減少/缺乏癥的治療效果，也是建立此動物模型的初衷。

研究結(jié)果顯示，PEG-rhGCSF可以升高外周血白細胞數(shù)，主要表現(xiàn)為提高中性粒細胞百分比，迅速促進損傷機體造血功能的恢復(fù)，減少發(fā)熱或感染的發(fā)生，且治療效果存在劑量依賴性。骨髓涂片結(jié)果顯示，給藥組獼猴骨髓增生活躍，主要是粒系增殖、分化成熟，由骨髓釋放至外周血液，發(fā)揮升高外周血白細胞功效。PEG-rhGCSF較rhGCSF，藥效作用明顯延長，其單次給藥后升高白細胞、中性粒細胞的藥效作用與rhGCSF多次給藥相當(dāng)。

作為一種新型、安全、長效的 rhGCSF制劑，PEG-rhGCSF不但降低了給藥頻率及治療成本，提高患者的依從性，而且還可以減少血藥濃度的波動及多次注射引起的不良反應(yīng)，有著良好的臨床應(yīng)用前景，本文的研究結(jié)果為今后該藥的進一步臨床研究提供了參考和依據(jù)。

［1］Link Dc.Mechanisms of granulocyte colony-stimulating factor-induced hematopoietic progenitor-cell mobilization［J］.Semin Hematol，2000，37(Suppl 2):25-32.

［2］Dale DC.Advances in the treatment of neutropenia［J］.Curr Opin Support Palliat Care，2009，3(3):207-212.

［3］Sung L，Dror Y.Clinical applications of granulocytecolony stimulating factor［J］.Front Biosci，2007，12:1988-2002.

［4］Renwick W，Pettengell R，Green M.Use of filgrastim and pegfilgrastim to support delivery of chemotherapy:twenty years of clinical experience［J］.BioDrugs，2009，23(3):175-186.

［5］Shi YK， Sun Y. Application of hematopoietic growth factors in malignancy chemotherapy［J］.Oncol Prog，2003，1(2，3):91-112.

［6］D'Souza A，Jaiyesimi I，Trainor L，Venuturumili P.Granulocyte colony-stimulating factor administration:adverse events［J］.Transfus Med Rev，2008，22(4):280-290.

［7］Shi YK， Liu P， Yang S， Han XH，He XH，Ai B，et al.PhaseⅠ clinical trial of intravenous pegylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor［J］.Chin J Cancer(癌癥)，2006，25(4):495-500.

［8］Mao BZ，Chen JP.Fundamental and Clinics of Acute Radiation Sickness(急性放射病基礎(chǔ)與臨床)［M］.Beijing:Military Medical Science Press，2002:134-138，152-157.

［9］Ma GC，Chen SQ，Zhu ZH，Huang YS，Pan HQ，Zhou JB.Pharmacokinetics of PEG-rhG-CSF and rHSA-hG-CSF in mice determined with ELISA［J］.Acta Pharmaceutica Sin，2007，42(2):197-200.

［10］Huang YS，Wen XF，Wu YL，Wang YF，F(xiàn)an M，Yang ZY，et al.Engineering a pharmacologically superior form of granulocyte-colony-stimulating factor by fusion with gelatin-like-protein polymer［J］.Eur J Pharm Biopharm，2010，74(3):435-441.

［11］Veronese FM，Mero A.The impact of PEGylation on biological therapies［J］.BioDrugs，2008，22(5):315-329.

［12］Morishita M，Leonard RC.Pegfilgrastim;a neutrophil mediated granulocyte colony stimulating factor-expanding uses in cancer chemotherapy［J］.Expert Opin Biol Ther，2008，8(7):993-1001.