劉 云，包瓊瓊，莊曉賽，胡 喬，孫妙璇，周莉莉，張 雄

(溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院神經內科，浙江溫州 325027)

梓醇是地黃中提取的單體活性成分，具有抗癌、抗炎、利尿和降血糖等多種生物學活性。近幾年來，梓醇在神經保護尤其是神經退行性疾病方面的作用受到越來越多的關注。據(jù)報道，梓醇能夠改善1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropypridine，MPTP)和魚藤酮導致的中腦細胞元損傷［1－3］、改善過氧化氫(H2O2)誘導的PC12細胞及星形膠質細胞的損傷［4－5］以及改善淀粉樣β蛋白片段25－35(amyloidβprotein fragment 25 －35，Aβ25–35)誘導的認知功能障礙［6］。帕金森病(Parkinson disease，PD)是我國第二大神經退行性疾病，證據(jù)顯示PD發(fā)病率在65歲以上的老年人約為1.7%［7］。盡管PD具體的病因復雜而且不明確，但是目前泛素-蛋白酶體功能障礙在PD發(fā)病中的作用已得到廣泛認可［8］。研究表明，20S蛋白酶體抑制劑導致的蛋白酶體功能障礙是導致中腦多巴胺(dopamine，DA)神經元變性的主要原因［9－10］。因此能夠改善細胞內20S蛋白酶體含量和功能的藥物可以選擇作為PD治療的潛在藥物。

乳胞素可抑制20S蛋白酶體多種肽酶的活性，是建立蛋白酶體功能障礙性PD模型的公認藥物［11］。SH-SY5Y細胞是國內外研究 PD的常見細胞模型［12］。梓醇雖具有多重神經細胞保護功能［13］，但目前對于梓醇在蛋白酶體功能障礙方面的影響還鮮有報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，復方地黃能夠拮抗6-羥基多巴胺誘導的PD大鼠模型中黑質DA能神經元的丟失，發(fā)揮對DA神經元的保護功能(待發(fā)表)。本實驗選用蛋白酶體抑制劑乳胞素誘導SH-SY5Y細胞建立PD模型，探討梓醇在蛋白酶體功能障礙所致DA神經元損傷中是否具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器

SH-SY5Y細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所北京協(xié)和醫(yī)學院基礎醫(yī)學院;乳胞素購自美國Alexis公司，純度≥97%;梓醇購自上海同田公司，純度≥97%;RPMI1640培養(yǎng)基、0.05%胰蛋白酶-EDTA和噻唑藍(MTT)購自美國Gibco公司;胎牛血清購自美國Hyclone公司;FITC標記膜蛋白碘化丙啶(Annexin-fluorescein isothiocyanate/propodium iodide，F(xiàn)ITC-AnnexinⅤ/PI)細胞凋亡試劑盒和 Hoechst染色試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司;人20S蛋白酶體定量檢測試劑盒購自德國IBL公司。倒置顯微鏡為日本Nikon公司產品;熒光顯微鏡為日本Olympus公司產品;流式細胞儀為美國BD公司產品;全自動酶標儀為美國Bio-Tek公司產品。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

SH-SY5Y細胞采用含有10%胎牛血清的R1640培養(yǎng)基，添加青霉素 100 kU·L－1、鏈霉素100 mg·L－1，置于恒溫 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。根據(jù)相關文獻報道［7－8］，及預實驗結果設梓醇濃度10 μmol·L－1，干預時間為 1 h。

細胞分成正常對照組，不加任何藥物;乳胞素組加入乳胞素10μmol·L－1作用24 h;梓醇預處理組先加入梓醇10μmol·L－1預處理1 h后，再加入乳胞素10μmol·L－1繼續(xù)培養(yǎng)24 h;梓醇組加入梓醇10μmol·L－1單獨作用 1 h后完全培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)24 h;實驗至少重復3次。

1.3 觀察SH-SY5Y細胞形態(tài)改變

每組細胞相應處理結束后，吸取培養(yǎng)板里培養(yǎng)液，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，將細胞培養(yǎng)板放到倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 MTT法檢測細胞存活率

細胞消化成單細胞懸液后接種到96孔板，按照每孔10 000個接種，設6個復孔。細胞貼壁后按照實驗分組給予藥物處理，處理結束后加入20μl MTT(5 g·L－1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸掉培養(yǎng)液，加入二甲亞砜(DMSO)每孔150μl，搖床上輕輕振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長490 nm處檢測各組細胞的吸光度(absorbance，A)。為消除培養(yǎng)板和培養(yǎng)基對結果的影響，實驗同時設空白對照組。細胞存活率(%)=(A實驗組－A空白組)/(A實驗組－A空白組)×100%。

1.5 AnnexinⅤ-FITC流式細胞儀分析細胞凋亡率

細胞培養(yǎng)結束后，消化貼壁的SH-SY5Y細胞為單個細胞懸液，離心去上清，PBS洗滌計數(shù)細胞，收集(1～5)×105個細胞，離心去上清，加入緩沖液300μl重懸細胞，加入5μl AnnexinⅤ-FITC，將其混勻后加入5μl PI，室溫避光染色30 min后，流式細胞儀檢測凋亡率。凋亡率為計數(shù)1×104個細胞中凋亡細胞所占百分比。

1.6 Hoechst33258染色檢測細胞核形態(tài)變化

細胞接種密度為每孔(1～2)×104個，藥物處理結束后，加入0.5 ml固定液固定，PBS洗滌，加入0.5 ml Hoechst33258染色液避光反應10 min，以紫外340 nm波長激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)。正常細胞核出現(xiàn)彌漫均勻的低強度熒光，細胞核如呈濃染致密的固縮形態(tài)，記為凋亡的細胞，每組3張不同的玻片上各隨機選取4個視野計數(shù)，凋亡率(%)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.7 雙抗體包被法檢測細胞內20S蛋白酶體含量

培養(yǎng)結束，消化SH-SY5Y細胞，離心，PBS重懸細胞密度為1×109L－1，反復凍融法裂解細胞，1040×g離心20 min，取上清液。每空加入標準品或待測樣品100μl，每組設8個復孔并設立空白對照孔，經溫育、洗滌、酶標、顯色后，酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm下檢測A，根據(jù)標準品的A繪制出標準曲線，再根據(jù)標準曲線和待測樣品A計算出待測樣品中蛋白酶體含量(μg·L－1)。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 梓醇對乳胞素誘導的SH-SY5Y細胞形態(tài)的影響

正常對照組和梓醇10μmol·L－1組細胞呈扁平多邊形，貼壁良好，細胞周邊有突起(圖1A，B);乳胞素10μmol·L－1組細胞胞體腫脹變圓變小，突起減少，周邊折光性增強(圖1C);梓醇10μmol·L－1預處理組較乳胞素10μmol·L－1組細胞突起增多，貼壁明顯改善及周邊折光性減弱(圖1D)。

Fig.1 Effect of catalpol on lactacystin-induced cell morphology changes in SH-SY5Y cells(×200).A:normal control group;B:catalpol 10 μmol·L －1 group;C:lactacystin 10 μmol·L －1 group;D:catalpol 10 μmol·L －1+lactacystin 10 μmol·L －1 group.

2.2 梓醇對乳胞素誘導的SH-SY5Y細胞存活的影響

梓醇10 μmol·L－1組細胞存活率為(99.7 ±3.0)%，與正常對照組相(100.0 ±2.5)%相比，無統(tǒng)計學差異;乳胞素10 μmol·L－1組細胞存活率(72.0 ±1.8)%明顯下降(P ＜0.05);梓醇 10 μmol·L－1預處理組細胞存活率為(87.9±2.2)%，與乳胞素組相比明顯升高(P ＜0.05)。

2.3 梓醇對乳胞素誘導的SH-SY5Y細胞凋亡率的影響

流式細胞雙染結果(圖2)顯示，與正常對照組細胞凋亡率 (33.6±2.1)% 相比，乳胞素10 μmol·L－1組細胞凋亡率為(64.7 ±2.6)%，明顯增加(P ＜0.05);梓醇10 μmol·L－1預處理組細胞凋亡率為(51.4±1.5)%，與乳胞素組比較明顯下降(P ＜0.05)。

Fig.2 Effect of catalpol on lactacystin-induced cell apoptotic rate changes in SH-SY5Y cells.A:normal control group;B:catalpol 10 μmol·L －1 group;C:lactacystin 10 μmol·L －1 group;D:catalpol 10 μmol·L －1+lactacystin 10 μmol·L －1 group.

2.4 梓醇對乳胞素誘導的SH-SY5Y細胞核形態(tài)的影響

熒光顯微鏡下觀察SH-SY5Y細胞核形態(tài)發(fā)現(xiàn)，正常對照組與梓醇組細胞核邊緣光滑整齊，呈藍色，均勻淡染(圖 3A，B);乳胞素10 μmol·L－1組可見凋亡特征性改變，如細胞核固縮，邊緣不整齊，呈碎塊狀致密濃染，甚至可看核裂解(圖3C);與乳胞素10 μmol·L－1組比較，梓醇 10 μmol·L－1預處理組細胞核形態(tài)明顯改善，細胞核固縮裂解減少(圖3D)。與正常對照組細胞凋亡率(18.7±1.5)%相比，乳胞素10 μmol·L－1組細胞凋亡率為(48.5 ±2.3)%，明顯升高(P ＜0.05);梓醇10 μmol·L－1預處理組細胞凋亡率為(25.7±2.3)%，與乳胞素組相比較明顯降低(P ＜0.05)。

Fig.3 Effect of catalpol on lactacystin-induced nuclear morphology changes in SH-SY5Y cells(Hoechest33258 staining × 400).A:normal control group;B:catalpol 10 μmol·L－1 group;C:lactacystin 10 μmol·L －1 group;D:catalpol 10 μmol·L －1+lactacystin 10 μmol·L －1 group.

2.5 梓醇對乳胞素誘導的SH-SY5Y細胞內20S蛋白酶體含量的影響

ELISA結果顯示，與正常對照組細胞內20S蛋白酶體含量(58.2 ± 1.6)μg·L－1相比，乳胞素10 μmol·L－1組細胞內蛋白酶體含量為(23.8 ±2.1)μg·L－1，明顯降低(n=3，P ＜0.05);與乳胞素10 μmol·L－1組相比，梓醇10 μmol·L－1預處理組細胞內蛋白酶體含量為(42.2 ±2.2)μg·L－1，明顯升高(n=3，P ＜0.05)。

3 討論

有研究表明，在PD發(fā)病過程中存在細胞的凋亡，Agid等［14］檢測黑質DA神經元凋亡形態(tài)學和生化過程發(fā)現(xiàn)，在PD患者腦內DA神經元有細胞凋亡特征性改變，提示細胞凋亡可能是DA神經元變性的基本步驟。據(jù)報道，地黃配成復方制劑對神經元細胞凋亡有明顯的抑制作用［15］。而梓醇是地黃中的主要活性成分，具有多種神經保護作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，經蛋白酶體抑制劑乳胞素處理后，SH-SY5Y細胞的凋亡率增加以及細胞核固縮裂解增加;而低濃度梓醇預處理后再進行乳胞素處理，細胞的形態(tài)得到改善、存活率升高和凋亡率下降及細胞核固縮裂解現(xiàn)象減少。提示梓醇能夠減少乳胞素誘導的SH-SY5Y細胞凋亡，發(fā)揮對乳胞素誘導的DA神經元的保護功能。

泛素蛋白酶體是體內蛋白降解的重要通道，在多種細胞周期性增殖及凋亡相關蛋白的降解中發(fā)揮重要作用。據(jù)報道，PD可能是一種蛋白降解障礙疾病［16］，并且在PD中泛素-蛋白酶體功能障礙與多巴胺能神經元的凋亡存在密切的關系［17］。本實驗發(fā)現(xiàn)，單用乳胞素處理細胞24 h后，細胞內蛋白酶體含量明顯下降，而低濃度梓醇預處理后能夠抑制乳胞素誘導的細胞內蛋白酶體含量下降。推測梓醇的神經保護可能與其提高細胞內蛋白酶體含量有關。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，梓醇預處理后可以逆轉蛋白酶體抑制劑乳胞素誘導的DA神經元細胞的凋亡，并推測其機制可能與提高細胞內蛋白酶體含量有關。首次從蛋白酶體途徑上說明了梓醇的神經保護作用，為梓醇在神經退行性疾病PD的防治方面提供了有力的實驗證據(jù)。本次實驗從對蛋白酶體含量的影響上展現(xiàn)了梓醇對DA神經元的保護作用，其具體機制及其對蛋白酶體功能方面的影響將是本課題組下一步研究目標。

［1］Xu G，Xiong Z，Yong Y，Wang Z，Ke Z，Xia Z，et al.Catalpol attenuates MPTPinduced neuronal degeneration of nigral-striatal dopaminergic pathway in mice through elevating glial cell derived neurotrophic factor in striatum［J］.Neuroscience，2010，167(1):174-184.

［2］Bi J，Wang XB，Chen L，Hao S，An LJ，Jiang B，et al.Catalpol protects mesencephalic neurons against MPTPinduced neurotoxicity via attenuation of mitochondrial dysfunction and MAO-B activity［J］.Toxicol In Vitro，2008，22(8):1883-1889.

［3］Bi J，Jiang B，Hao S，Zhang A，Dong Y，Jiang T，et al.Catalpol attenuates nitric oxide increase via ERK signaling pathways induced by rotenone in mesencephalic neurons［J］.Neurochem Int，2009，54(3-4):264-270.

［4］Jiang B，Liu JH，Bao YM，An LJ.Catalpol inhibits apoptosis in hydrogen peroxide-induced PC12 cells by preventing cytochrome c release and inactivating of caspase cascade［J］.Toxicon，2004，43(1):53-59.

［5］Zhang ZQ，Liu YM，Xue BQ，Wei L.Protective effects of catalpol against H2O2induced oxidative damage in astrocytes［J］.China J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2009，34(15):1955-1958.

［6］Wang Z，Liu Q，Zhang R，Liu S，Xia Z，Hu Y.Catalpol ameliorates beta amyloid-induced degeneration of cholinergic neurons by elevating brain-derived neurotrophic factors［J］.Neuroscience，2009，163(4):1363-1372.

［7］Zhang ZX， Roman GC， Hong Z， Wu CB，Qu QM，Huang JB，et al.Parkinson's disease in China:prevalence in Beijing，Xi'an，and Shanghai［J］.Lancet，2005，365(9459):595-597.

［8］Mandel SA，Amit T，Kalfon L，Reznichenko L，Youdim MB.Targeting multiple neurodegenerative diseases etiologies with multimodal-acting green tea catechins［J］.J Nutr，2008，138(8):1578S-1583S.

［9］Li X，Yang D，Li L，Peng C，Chen S，Le W.Proteasome inhibitor lactacystin disturbs the intracellular calcium homeostasis of dopamine neurons in ventral mesencephalic cultures［J］.Neurochem Int，2007，50(7-8):959-965.

［10］Li X，Du Y，F(xiàn)an X，Yang D，Luo G，Le W.c-Jun N-terminal kinase mediates lactacystin－induced dopamine neuron degeneration［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2008，67(10):933-944.

［11］Xie W，Li X，Li C，Zhu W，Jankovic J，Le W.Proteasome inhibition modeling nigral neuron degeneration in Parkinson's disease［J］.J Neurochem，2010，115(1):188-199.

［12］Biedler JL，Roffler-Tarlov S，Schachner M，F(xiàn)reedman LS.Multiple neurotransmitter synthesis by human neuroblastoma cell lines and clones［J］.Cancer Res，1978，38(11 Pt 1):3751-3757.

［13］Zhu HF，Wan D，Zhang F.Progress in studies of pharmacological action and mechanisms of catalpol on brain disease［J］.China J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2009，34(23):2983-2986.

［14］Agid Y.Aging，disease and nerve cell death［J］.Bull Acad Natl Med，1995，179(6):1193-1203.

［15］Wang ZH，He JC，Zhang CY.Effect of compound rehmannia recipe on appotosis in Parkinson's disease rats［J］.J New Chin Med(新中醫(yī))，2010，42(14):86-88.

［16］McNaught KS，Olanow CW.Proteolytic stress:A unifying concept for the etiopathogenesis of parkinson's［J］.Ann Neurol，2003，53(3):S73-S86，

［17］Yew PR. Ubiquitin-mediated proteolysis of vertebrate G1-and S-phase regulators［J］.J Cell Physiol，2001，187(1):1-10.