李延紅，周占業(yè)，史 齊，皇甫超申

(河南大學(xué)1.醫(yī)學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，2.第一附屬醫(yī)院，河南開封 475004)

亞硝酸鹽廣泛存在于自然界水體、土壤、植物中，常用于食品保鮮劑和工業(yè)防腐劑，也被用于臨床治療氰化物中毒。亞硝酸鹽對人體健康的影響目前存在很大爭議［1］。過去普遍認(rèn)為亞硝酸鹽可以導(dǎo)致高鐵血紅蛋白血癥并有致癌風(fēng)險，現(xiàn)在不斷有研究表明，低濃度亞硝酸鹽具有保護(hù)血管內(nèi)皮、降血壓和預(yù)防動脈粥樣硬化等對人體有利的一面［2］。這就使得亞硝酸鹽這一古老的化合物有了新的研究價值。有實驗表明，環(huán)境化學(xué)毒物或物理損傷因子對組織細(xì)胞的作用效應(yīng)呈現(xiàn)出低濃度和高濃度作用相反的現(xiàn)象，該現(xiàn)象被稱為低促效應(yīng)(hormesis)［3］，化合物在低促效應(yīng)濃度范圍內(nèi)引起的促進(jìn)效應(yīng)超過對照組10%的濃度稱之為最低促進(jìn)濃度，用該濃度化合物預(yù)處理組織細(xì)胞，可以使其耐受該化合物高濃度的毒害作用［4］。為此，本文研究了低濃度亞硝酸鈉(NaNO2)預(yù)處理對高濃度NaNO2損傷PC細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤未分化型細(xì)胞株P(guān)C12購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。硝酸鈉(NaNO3)、NaNO2，無水乙醇，天津市晨?；瘜W(xué)試劑廠(分析純);高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清，杭州四季青生物公司產(chǎn)品;羧基-2-(4-羧基)苯基-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-1-氧-3-氧化物(carboxy-2-(4-carbo-xyphenyl)-4，4，5，5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide，c-PTIO)、二甲亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)、Hoechst33258和碘化丙啶(propodium iodiole，PI)購自Sigma公司。FITC-AnnexinⅤ/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Bender)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG及β肌動蛋白抗體(碧云天公司)?？梢姽夥ū?malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。BX51型熒光顯微鏡(日本Olympus公司);FACS Salibur型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞生長在含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置5%CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3 d換液1次為1代。

1.3 MTT分析細(xì)胞存活率

PC12細(xì)胞于5%CO237℃恒溫培養(yǎng)。至對數(shù)生長期，用胰酶和EDTA消化，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107L－1接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換液。根據(jù)前期實驗結(jié)果［5］，本實驗分別選用NaNO20.14，1.4 和 45 mmol·L－1濃度組，同時設(shè)同濃度的 NaNO3或 c-PTIO 40 μmol·L－1+NaNO3組。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入 20 μl MTT 5 g·L－1培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO于振蕩器上振搖，待藍(lán)色晶體完全溶解后，在酶標(biāo)儀上測定570 nm處的吸光度(absorbance，A)。以含有等體積的培養(yǎng)液和DMSO的無細(xì)胞孔測得的吸光度值為空白對照。實驗重復(fù)3次。細(xì)胞存活率(%)=(A處理組－A空白組)/(A對照組－A空白組)×100% 。

1.4 活細(xì)胞熒光染色判定細(xì)胞生存狀態(tài)

實驗分4組:正常對照組，只加等體積的培養(yǎng)液;NaNO245 mmol·L－1組，NaNO245 mmol·L－1處理細(xì)胞2 h;預(yù)處理組，NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理24 h，然后再用 NaNO245 mmol·L－1處理 2 h;NO 清除組，c-PTIO 40 μmol·L－1+NaNO20.14 mmol·L－1共同預(yù)處理細(xì)胞24 h后再用NaNO245 mmol·L－1作用2 h。將不同處理的細(xì)胞培養(yǎng)在預(yù)置蓋玻片上，PBS洗3次，用特異結(jié)合DNA的熒光染料Hoechst 33258和PI聯(lián)染進(jìn)行活細(xì)胞聯(lián)染。加Hoechst33258 10 mg·L－1及 PI 10 mg·L－1，37℃染色 15 min 后，紫外激發(fā)，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，CCD拍片。活細(xì)胞呈淺藍(lán)色，凋亡細(xì)胞呈凝集的紅色或亮白色。熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野，每張爬片計數(shù)細(xì)胞不少于1000個，實驗重復(fù)3次，以凋亡細(xì)胞數(shù)與計數(shù)的總細(xì)胞數(shù)百分比表示細(xì)胞凋亡率。

1.5 FITC-AnnexinⅤ/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡

按實驗要求處理后，分別收集各組細(xì)胞到10 ml的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為1×109L－1，1000 ×g離心5 min，棄去培養(yǎng)液。用孵育緩沖液洗滌1次，1000×g離心5 min，用100μl的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育15 min，1000×g離心5 min，沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次。加入AnnexinⅤ-FITC/PI溶液5 μl，4℃下孵育20 min，最后補 PBS 400 μl，以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。每個樣品檢測1萬個細(xì)胞，用Cellquest軟件進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.6 細(xì)胞內(nèi)MDA含量和GSH-Px，SOD，CAT酶活性分析

實驗步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，比色法測定細(xì)胞內(nèi)MDA，GSH-Px含量和SOD，CAT酶活性。實驗重復(fù)3次。

1.7 Western印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

細(xì)胞于對數(shù)生長期進(jìn)行各種處理，作用24 h后用RIPA 200μl充分裂解提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250法測樣品蛋白濃度，均衡每組蛋白濃度后，以12%SDS-PAGE凝膠電泳分離。電轉(zhuǎn)移蛋白至NC膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入各種一抗(1∶200)于4℃封閉袋中孵育過夜，二抗(1∶4000)孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果，壓片曝光，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，并測定蛋白質(zhì)印跡條帶積分吸光度值(integrated absorbance，IA)，以 與β肌動蛋白的IA比值為蛋白相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NaNO2對PC12細(xì)胞存活率的影響

圖1 結(jié)果顯示，NaNO20.14 和 1.4 mmol·L－1組細(xì)胞存活率較正常對照組分別增加15%和56%，NaNO245 mmol·L－1組細(xì)胞存活率較正常對照組減少46%(P＜0.05)。同時加入c-PTIO后，細(xì)胞存活率較相應(yīng)濃度單獨NaNO2組明顯降低(P＜0.05)，但NaNO2對細(xì)胞存活率的低濃度促進(jìn)高濃度抑制現(xiàn)象依然存在，未恢復(fù)至正常對照組水平(P＜0.05)。NaNO30.14 ～45 mmol·L－1對細(xì)胞存活無明顯影響。

Fig.1 Effect of sodium nitrite(NaNO2)on the survival rate of PC12 cells.PC12 cells were cultured with drugs for 24 h.Survival rate(%)=(A treatment － A blank)/(A control － A blank).ˉx ± s，n=3.*P ＜0.05，compared with normal control(0 mg·L －1)group;#P ＜0.05，compared with NaNO2 group.

2.2 低濃度NaNO2預(yù)處理對高濃度NaNO2損傷PC12細(xì)胞存活率的影響

如圖2所示，與正常對照組相比，NaNO245 mmol·L－1處理組細(xì)胞存活率明顯下降(P ＜0.05)。與NaNO245 mmol·L－1組相比，預(yù)處理組細(xì)胞存活率明顯增加(P＜0.05)。與預(yù)處理組相比，預(yù)處理時同時加入c-PTIO 40μmol·L－1的NO清除組細(xì)胞存活率進(jìn)一步明顯下降(P＜0.05)。

Fig.2 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L －1 preconditioning on cell survival exposed to NaNO2 45 mmol·L －1 by MTT.Cells were preconditioned with NaNO2 0.14 mmol· L－1 or NaNO2 0.14 mmol·L －1+c-PITO 40 μmol·L－1 for 24 h， then NaNO2 45 mmol·L －1 was added for anther 2 h cultivation.1:normal control group;2:NaNO2 group;3:NaNO2 0.14+NaNO2 45 group;4:c-PTIO+NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group;#P ＜0.05，compared with NaNO2 45 group;ΔP ＜0.05，compared with NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.

2.3 低濃度NaNO2預(yù)處理對高濃度NaNO2損傷PC12細(xì)胞凋亡的拮抗作用

FITC-AnnexinⅤ/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果(圖3)可見，正常對照組PC12細(xì)胞有少量細(xì)胞凋亡，NaNO245 mmol·L－1可誘導(dǎo)大批細(xì)胞凋亡，與正常對照組相比差異顯著(P＜0.05)。與NaNO245 mmol·L－1組相比，NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率明顯減少(P＜0.05);與 NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理組相比，c-PTIO+NaNO20.14+NaNO245 mmol·L－1組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增高(P＜0.05)。

2.4 低濃度NaNO2預(yù)處理對NaNO2高度濃損傷PC12細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

Fig.3 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L －1 preconditioning on cell apoptosis exposed to NaNO2 45 mmol·L －1 by FITC-annexinⅤ/PI double staining flow cytometry assay.See Fig.2 for the treatment.1:normal control group;2:NaNO2 group;3:NaNO2 0.14+NaNO2 45 group;4:c-PTIO+NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group;#P ＜0.05，compared with NaNO2 45 group;ΔP ＜0.05，compared with NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.

Hoechst33258/PI活細(xì)胞雙染結(jié)果可見(圖4)，正常對照組細(xì)胞，生存狀態(tài)良好，有少量細(xì)胞凋亡;NaNO245 mmol·L－1處理導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡，凋亡率明顯高于正常對照組(P＜0.05);預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率與NaNO245 mmol·L－1組相比 ，明顯減少 (P＜0.05);與預(yù)處理組相比，c-PTIO+NaNO20.14+NaNO245組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P＜0.05)。

2.5 低濃度NaNO2預(yù)處理對高濃度NaNO2損傷PC12細(xì)胞抗氧化能力的影響

如表1所示，與正常對照組相比，NaNO245 mmol·L－1處理組細(xì)胞內(nèi) CAT、SOD 和 GSH-Px活性明顯降低，MDA含量升高(P＜0.05);與NaNO245 mmol·L－1組相比，NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力明顯升高，而MDA含量明顯下降(P ＜0.05)。與 NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理組相比，c-PTIO 40 μmol·L－1+NaNO20.14+NaNO245組抗氧化酶活性進(jìn)一步明顯降低，MDA含量明顯升高(P＜0.05)。

Fig.4 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L －1 preconditioning on cell nucleus morphology exposed to NaNO2 45 mmol·L －1 by Hoechst33258/PI double staining.See Fig.3 for the legend.B was the statistical results of A.±s，n=3.*P＜0.05，compared with control group;#P ＜0.05，compared with NaNO2 45 group;ΔP ＜0.05，compared with NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.

Tab.1 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L －1 preconditioning on activities of catalase(CAT)，superoxide dismutase(SOD)，glutathione peroxidase(GSH-Px)and malondialdehyde(MDA)content in PC12 cells exposed to NaNO2 45 mmol·L －1

2.6 低濃度NaNO2預(yù)處理對高濃度NaNO2損傷PC12細(xì)胞影響

圖5結(jié)果顯示，與對正常照組相比，NaNO245 mmol·L－1處理細(xì)胞可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞促凋亡蛋白Bax，胱天蛋白酶9，胱天蛋白酶3表達(dá)增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)減少(P＜0.05)。與NaNO245 mmol·L－1組相比，NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理組細(xì)胞促凋亡蛋白 Bax，胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3表達(dá)量下降，而凋亡抑制蛋白 Bcl-2表達(dá)量增加(P＜0.05)。與預(yù)處理組相比，c-PTIO+NaNO20.14+NaNO245組細(xì)胞促凋亡蛋白Bax，胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3表達(dá)量有所增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)量有所減少(P＜0.05)。

Fig.5 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L－1 preconditioning on the expression of apoptosis-related proteins in cells exposed to NaNO2 45 mmol·L－1 by Western blotting assay.See Fig.3 for the legend.Bwas the statistical results of A.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group;#P ＜0.05，compared with NaNO2 45 mmol·L －1 group;ΔP ＜0.05，compared with NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.

2.7 低濃度NaNO2預(yù)處理對高濃度NaNO2損傷PC12細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

圖6結(jié)果顯示，與正常對照組相比，NaNO245 mmol·L－1組細(xì)胞 HIF-1α 表達(dá)量有所增加(P ＜0.05);與 NaNO245 mmol·L－1組相比，NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理組 HIF-1α 表達(dá)量明顯增加(P ＜0.05);與 NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理組相比，c-PTIO+NaNO20.14+NaNO245 組 HIF-1α 表達(dá)量進(jìn)一步明顯下降(P＜0.05)。

Fig.6 Effect of NaNO2 0.14 mmol·L －1 preconditioning on the expression of hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α)in PC12 cells exposed to NaNO2 45 mmol·L －1 by Western blotting assay.See Fig.3 for the legend.Fig.B was the statistical results of Fig.A.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group;#P ＜ 0.05，compared with NaNO2 45 mmol·L －1 group;ΔP ＜0.05，compared with NaNO2 0.14+NaNO2 45 group.

3 討論

高濃度NaNO2可以造成細(xì)胞膜損害和DNA過氧化損傷，并誘導(dǎo)細(xì)胞壞死和凋亡［6］，低濃度NaNO2對組織細(xì)胞卻沒有明顯的毒害作用［7］。本實驗發(fā)現(xiàn)，NaNO20.14 和 1.4 mmol·L－1對 PC12 細(xì)胞存活率有促進(jìn)作用，而 NaNO245 mmol·L－1明顯抑制細(xì)胞存活率;加入c-PTIO清除培養(yǎng)體系中的一氧化氮后，細(xì)胞存活率總體有所下降，但NaNO2對細(xì)胞存活率的低濃度促進(jìn)高濃度抑制現(xiàn)象依然存在，而相同濃度的硝酸鈉對細(xì)胞活力無影響。結(jié)果提示，NaNO2可以引起PC12細(xì)胞存活率低濃度促進(jìn)效應(yīng)(低促效應(yīng))。這種現(xiàn)象很可能與一氧化氮-可溶性鳥苷酸環(huán)化酶-環(huán)一磷酸鳥苷通路激活有關(guān)［8］。在低促效應(yīng)濃度范圍內(nèi)，本實驗選用最低促進(jìn)濃度，即 NaNO20.14 mmol·L－1預(yù)處理后，細(xì)胞抗氧化能力增強(qiáng)、脂質(zhì)過氧化水平降低、線粒體凋亡通路上促凋亡蛋白表達(dá)下降、凋亡抑制蛋白表達(dá)升高以及細(xì)胞凋亡減少。有研究認(rèn)為這種現(xiàn)象是由于低濃度毒物預(yù)處理，細(xì)胞通過自穩(wěn)態(tài)調(diào)整，獲得了耐受更高濃度毒物的損害作用［9］。也有研究認(rèn)為低濃度NaNO2在體內(nèi)缺氧酸性環(huán)境下可以還原為一氧化氮，一氧化氮抑制線粒體呼吸鏈，減少活性氧產(chǎn)生，抑制細(xì)胞色素C釋放，從而減輕細(xì)胞過氧化損害和拮抗線粒體途徑凋亡［10］。本實驗是在普通條件下培養(yǎng)的，培養(yǎng)液pH值由實驗開始時的7.3，到實驗結(jié)束時降到6.3左右，在這種環(huán)境，培養(yǎng)體系中的亞硝酸鹽有可能部分還原為一氧化氮。用低濃度NaNO2預(yù)處理 PC12細(xì)胞，細(xì)胞獲得耐受高濃度NaNO2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象很可能與亞硝酸根離子和一氧化氮抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物，抑制細(xì)胞內(nèi)氧的消費，減少活性氧產(chǎn)生，同時抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放，減少線粒體途徑凋亡有關(guān)。這種現(xiàn)象在NaNO2預(yù)處理拮抗缺血再灌注時活性氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡實驗中也得到證實［11］。

細(xì)胞內(nèi)HIF是一類進(jìn)化上高度保守的核轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧條件下累積，調(diào)控其下游紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子和糖酵解等一系列與細(xì)胞低氧存活有關(guān)的基因，使細(xì)胞耐受缺氧或其他應(yīng)激環(huán)境［12］。本實驗發(fā)現(xiàn)，低濃度NaNO2預(yù)處理的細(xì)胞，HIF表達(dá)增加，這可能與低濃度亞硝酸鹽抑制細(xì)胞氧消費有關(guān)。結(jié)果提示，低濃度NaNO2促進(jìn)細(xì)胞存活率增加，拮抗高濃度NaNO2對細(xì)胞過氧化損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，與其促進(jìn)HIF在細(xì)胞內(nèi)累積增加有關(guān)。

低濃度NaNO2促進(jìn)PC12細(xì)胞存活率，高濃度抑制其存活率;低濃度NaNO2預(yù)處理PC12細(xì)胞可以增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，增加HIF-1α在細(xì)胞內(nèi)累積，拮抗高濃度NaNO2過氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體途徑凋亡，亞硝酸鹽還原的一氧化氮和亞硝酸根離子在其中協(xié)同發(fā)揮了重要作用。

［1］Bryan NS，Calvert JW，Gundewar S，Lefer DJ.Dietary nitrite restores NO homeostasis and is cardioprotective in endothelial nitric oxide synthase-deficient mice［J］.Free Radic Biol Med，2008，45(4):468-474.

［2］Hord NG，Tang Y，Bryan NS.Food sources of nitrates and nitrites:the physiologic context for potential health benefits［J］.Am J Clin Nutr，2009，90(1):1-10.

［3］Calabrese E.Hormesis，non-linearity，and risk communication［J］.Hum Exp Toxicol，2009，28(1):5-6.

［4］Calabrese EJ. Converging concepts:adaptive response，preconditioning，and the Yerkes-Dodson Law are manifestations of hormesis［J］.Ageing Res Rev，2008，7(1):8-20.

［5］Li YH，Shi Q，Shi ZY，Li YQ，Liu B，Huangfu CS.cytoprotective role of low-dose nitrite preconditioning against H2O2induced damage in PC12 cells［J］.Chin J Pathophysiol(中國病理生理雜志)，2010，26(4):802-808.

［6］Wyatt N，Kelly C，F(xiàn)ontana V，Merlo DF，Whitelaw D，Anderson D.The responses of lymphocytes from Asian and Caucasian diabetic patients and non－diabetics to hydrogen peroxide and sodium nitrite in the Comet assay［J］.Mutat Res，2006，609(2):154-164.

［7］Hansen PR， Taxvig C， Christiansen S， Axelstad M，Boberg J，Kiersgaard MK，et al.Evaluation of endocrine disrupting effects of nitrate after in utero exposure in rats and of nitrate and nitrite in the H295R and T-screen assay［J］.Toxicol Sci，2009，108(2):437-444.

［8］Mujoo K，Sharin VG，Martin E，Choi BK，Sloan C，Nikonoff LE，et al.Role of soluble guanylyl cyclase-cyclic GMPsignaling in tumor cell proliferation［J］.Nitric Oxide，2010，22(1):43-50.

［9］Calabrese EJ，Baldwin LA.Toxicology rethinks its central belief［J］.Nature，2003，421(6924):691-692.

［10］Bryan NS， Fernandez BO， Bauer SM， Garcia-Saura MF，Milsom AB，Rassaf T，et al.Nitrite is a signaling molecule and regulator of gene expression in mammalian tissues［J］.Nat Chem Biol，2005，1(5):290-297.

［11］Duranski MR， Greer JJ， Dejam A， Jaganmohan S，Hogg N，Langston W，et al.Cytoprotective effects of nitrite during in vivo ischemia-reperfusion of the heart and liver［J］.J Clin Invest，2005，115(5):1232-1240.

［12］Podar K，Anderson KC.A therapeutic role for targeting c-Myc/Hif-1-dependent signaling pathways［J］.Cell Cycle，2010，9(9):1722-1728.