譚州科，唐 智，羅 茜，楊亦彬

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

槲皮素對大鼠慢性環(huán)孢素腎病的保護作用

譚州科，唐 智，羅 茜，楊亦彬

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

目的建立慢性環(huán)孢素A腎病大鼠模型，觀察槲皮素對環(huán)孢素A導致慢性腎損害的影響。方法在低鹽飲食基礎上將SD大鼠分為四組：環(huán)孢素模型組、槲皮素干預組素、正常對照組、溶劑對照組。慢性環(huán)孢素腎病采用橄欖油稀釋環(huán)孢素A灌藥造模，槲皮素灌藥干預。4周后處死，分別測定腎功能、尿蛋白和體重變化；HE、Masson染色評判腎臟組織病理學改變及纖維化程度；免疫組化檢測腎臟組織TGF-β1的表達情況。結(jié)果①環(huán)孢素模型和槲皮素干預組大鼠體重明顯下降，其血肌酐水平和尿蛋白排泄量均較兩對照組明顯升高(P<0.01)，但槲皮素干預組上述指標改變明顯低于環(huán)孢素模型組(P<0.05)。②環(huán)孢素模型組腎臟病理組織學改變主要為小管間質(zhì)損傷，間質(zhì)纖維化,小管萎縮；槲皮素干預后腎小管損傷以及間質(zhì)纖維化積分明顯低于環(huán)孢素模型組(P<0.01)。③環(huán)孢素模型和槲皮素干預組腎組織TGF-β1較兩對照組明顯上調(diào)(P<0.01)，但槲皮素干預組腎組織TGF-β1表達明顯低于環(huán)孢素模型組(P<0.05)。結(jié)論槲皮素對慢性環(huán)孢素腎病有一定的保護作用，可能與降低尿蛋白排泄、下調(diào)腎組織TGF-β1的表達，延緩腎小管間質(zhì)纖維化進程有關(guān)。

槲皮素;環(huán)孢素;慢性腎毒性;腎小管間質(zhì)纖維化

環(huán)孢素A(CsA)作為一種有效的免疫抑制劑廣泛用于各種實體器官移植(如腎、肝、心等移植)，然而其慢性毒副作用導致的慢性環(huán)孢素腎病(CCN)限制了它的長期應用。CCN的主要特征為進行性的腎功能減退、小管間質(zhì)纖維化和炎細胞浸潤【1】。由于目前CsA仍是最重要的一線抗排斥反應藥，如何減輕CsA毒副作用倍受關(guān)注。槲皮素(QU)是一種從多種植物提取的黃酮類化合物，大量實驗證實具有抗肝纖維化、肺纖維化作用【2】，本實驗擬通過復制CsA的慢性環(huán)孢素腎病大鼠模型，觀察槲皮素對CsA致慢性腎損害的影響，為后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，月齡3～4個月，體重200～220g，由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，清潔級(合格證號SCXK(渝)20070003)。大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，光照/暗時間為12/12 h循環(huán)，室溫22～25℃。

1.2 主要藥品與試劑 CsA口服溶液由杭州中美華東制藥有限公司(50ml:5g)提供，QU購自美國Cayman chemical公司 (含量>95% )，兔抗大鼠TGF-β1多克隆一抗購自美國Santa Cruz公司。羊抗兔IgG 購自北京中杉生物技術(shù)公司。

1.3 實驗分組及給藥 低鹽飲食參考照Rosen等【3】介紹的配方，飼料配好后，測定鈉含量為0.046%(原子吸收火焰法測定)。低鹽飲食飼養(yǎng)7 d后，隨機分為4組：環(huán)孢素模型組、槲皮素干預組、溶劑對照組、正常對照組，每組6只鼠。將環(huán)孢素用橄欖油稀釋成8g/L,按劑量為25mg·kg- 1·d- 1；溶劑對照組采用橄欖油2.5 mL·kg- 1·d- 1；槲皮素干預組按以上方法給CsA后，參照文獻【4】給予槲皮素15 mg·kg- 1·d- 1,均采用灌胃,每天1次。正常對照組自由飲水。7 d稱一次體重，于第4周實驗終點前置大鼠于代謝籠，收集24 h尿液，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，下腔靜脈采血，分離血清保存于-70 ℃?zhèn)溆?；左腎矢狀面剖開，置于10%甲醛浸泡，用于組織學和免疫組織化學檢查。

1.4 大鼠一般狀況觀察 體重、飲食、尿量、皮毛、活動度等。

1.5 血、尿生化測定 尿蛋白、血肌酐采用全自動生化分析儀檢測。

1.6 腎組織病理學檢查 腎臟組織石蠟包埋切片，厚度為3～4 μm。HE染色切片在高倍鏡(×400)下,每例隨機選擇20個不重復視野觀察腎小管的變化，參考Shihab【5】報道的方法對標本進行半定量評分，腎小管損傷標準:①腎小管上皮細胞腫脹、小管擴張；②小管萎縮或塌陷；③ 細胞和細胞間空泡形成。評分標準：0分:無小管損傷；0.5 分：5<% 小管損傷；1.0 分:5%～20%小管損傷；1.5分:21%～35%小管損傷；2.0 分:36%～50%小管損傷；2.5分:51%～65%小管損傷；3.0分:>65%。Masson染色觀察間質(zhì)纖維化程度:在100×鏡下盡量避開腎小球和血管采集圖像，每例采集10個不重復視野，用HP IAS21000病理圖文分析系統(tǒng)根據(jù)病變的百分數(shù)判定積分【6】:0為無病變;0.5為<5% (每視野) ;1為5% ～15%;1.5為16% ～25%;2為26% ～35%;2.5為36%～45%;3為>45%。將呈現(xiàn)為綠色的區(qū)域作為陽性目標,以陽性面積與統(tǒng)計總面積的比值作為腎小管間質(zhì)纖維化的評分標準。

1.7 腎組織TGF-β1免疫組化 腎組織脫蠟、水化，3%H2O2中室溫放置，EDTA微波抗原修復，滴加一抗(兔抗大鼠TGF-β1)4℃冰箱過夜，復溫、清洗，加入二抗(羊抗兔IgG)37℃孵育，PBS清洗，DAB反應顯色，蘇木素復染，陽性著染可呈棕黃色。實驗均采用PBS代替第一抗體作陰性對照。每張切片隨機采腎臟皮質(zhì)部五個視野，應用計算機圖象分析軟件IPWin32進行圖片采集，以積分光密度(IOD)為指標對各組免疫組化染色進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 實驗中各組大鼠共死亡3只，環(huán)孢素組2只,槲皮素干預組1只，死亡原因主要是感染、腹腔膿腫等。正常和溶劑對照組大鼠精神狀況、飲食、尿量、皮毛、活動度等方面無明顯改變，而兩模型組(環(huán)孢素和槲皮素干預組)大鼠精神萎靡，活動差，飲食飲水量下降和毛發(fā)變黃、松亂，皮膚可見感染、破潰、膿腫等，但槲皮素干預組程度較輕。兩個模型組大鼠體重明顯低于正常或溶劑對照組 (P<0.01)，但槲皮素干預組大鼠體重卻高于環(huán)孢素組(P<0.05)，(見表1)。

2.2 常規(guī)血、尿生化指標 兩個模型組大鼠4周時血肌酐、尿蛋白均高于正常和溶劑對照組(P<0.01)，但環(huán)孢素模型組較槲皮素干預組升高更明顯(P<0.01)，見表1；空白和載體對照組間無明顯差異(P>0.05)，(見表1)。

表1 各組大鼠體重、血肌酐、尿蛋白情況

注：與正?；蛉軇φ战M比較，#P<0.01；與環(huán)孢素模型組比較，*P<0.01，★P<0.05。

2.3 腎臟常規(guī)病理學檢查 正常和溶劑對照組腎小球、腎小管和間質(zhì)未見明顯病理學改變。環(huán)孢素模型組、槲皮素干預組腎臟均可見明顯的小管和間質(zhì)改變，主要表現(xiàn)腎小管空泡變性，小管萎縮，腎間質(zhì)較多的炎癥細胞浸潤，間質(zhì)增寬，條帶狀間質(zhì)纖維化；槲皮素干預組腎小管損害和間質(zhì)纖維化評分明顯低于環(huán)孢素模型組(P<0.05)，(見表2)。

表2 各組大鼠腎小管損害和間質(zhì)纖維化積分

注：與正?；蛉軇φ战M比較，#P<0.01；與環(huán)孢素模型組比較，★P<0.05。

2.4 大鼠腎臟組織TGF-β1免疫組化檢測 正常對照組和溶劑對照組腎組織可見少許TGF-β1表達；兩模型組腎組織TGF-β1表達明顯增強(P<0.01)，主要見于腎小球、腎小管和腎間質(zhì)，但槲皮素干預組TGF-β1表達明顯低于環(huán)孢素模型組(P<0.01)，(見表3、圖1)。

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1表達水平(IOD值

注：與正?；蛉軇φ战M比較，#P<0.01；與環(huán)孢素模型組比較，*P<0.01。

注：A 正常對照組；B 溶劑對照組；C 環(huán)孢素模型組；D 槲皮素干預組。圖1 各組TGF-β1免疫組化圖

3 討論

隨著CsA在器官移植領(lǐng)域以及各種腎臟病變中的廣泛應用，其長期使用可能導致CCN從而影響移植物和患者的生存。由于目前CsA仍是最重要的器官移植一線抗排斥藥物并且尚無更好的替代藥物，因此，如何預防和減輕CsA的腎毒性、阻止或延緩CCN的進展頗受醫(yī)學界重視?，F(xiàn)階段對于CCN的防治主要是采取減少或撤除CsA，應用ACEI/ARB、抗氧化劑、他丁類降脂藥，但其效果報道不一，移植患者的長期存活率不樂觀【7】。

CCN病變以進行性腎功能不全、入球小動脈透明樣變性、炎癥細胞浸潤、腎小管萎縮伴上皮細胞空泡變性，條索狀間質(zhì)纖維化為主要特征。Rosen等【3】給大鼠喂養(yǎng)低鈉飼料，造成大鼠鈉耗竭(sodium depletion,SoD)，并持續(xù)給以CsA 4周后首次成功建立CCN模型。本實驗觀察到在環(huán)孢素模型組大鼠出現(xiàn)體重下降、精神萎靡，飲食飲水量下降和毛發(fā)變黃、松亂，皮膚可見感染、破潰等，腎功能進行性下降，組織病理學檢查見到腎小管損傷、空泡變性，小管萎縮，腎間質(zhì)纖維化等，結(jié)果與文獻報道一致的【8】；此外，由于CsA為脂溶性藥物，為便于實驗給藥本實驗采用橄欖油作為溶解介質(zhì)，實驗結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)空白對照組與橄欖油載體對照組間存在著觀察指標的差異，說明本實驗慢性環(huán)孢素腎病模型復制成功。

慢性CsA腎毒性的機制并不十分確切，多認為與腎內(nèi)RAS系統(tǒng)的激活，NO與NO合酶的失衡，TGF-β1表達上調(diào)，細胞調(diào)亡增加，炎癥介質(zhì)刺激等有關(guān)【1】。新近認為腎小管間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進展至終末期腎臟病的共同途徑【9】，故而，如何有效干預小管間質(zhì)纖維化進程已成為目前研究熱點。

槲皮素是一種黃酮類化合物，可從多種植物及中草藥中提取，大量實驗表明，槲皮素具有抗腫瘤、抗血小板聚集、抗氧化等作用。國內(nèi)外有學者觀察到槲皮素對于環(huán)孢素急性中毒引起的腎損傷有保護作用，其機制可能與其抗氧化作用有關(guān)【10】。近年，進一步研究發(fā)現(xiàn)槲皮素在肝纖維化、肺纖維化及部分腎纖維化動物模型中有明確的抗纖維化作用【2，11】。本實驗發(fā)現(xiàn)在給予槲皮素干預性治療后大鼠體重下降明顯減輕、血肌酐和尿蛋白也明顯降低，說明槲皮素有減少環(huán)孢素腎毒性所致的尿蛋白排泄，延緩腎功能惡化的作用。目前認為TGF-β1是各種腎臟疾病小管間質(zhì)纖維化進程中的關(guān)鍵因子，可通過多種途徑參與腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生和進展，如誘導其他促纖維化物質(zhì)的產(chǎn)生，促進細胞外基質(zhì)的合成，抑制細胞外基質(zhì)的降解，促進腎小管上皮細胞和間質(zhì)成纖維細胞的轉(zhuǎn)分化等【12】，本實驗結(jié)果顯示CsA模型組腎組織TGF-β1表達明顯上調(diào)，在同時給予槲皮素干預性治療后TGF-β1表達顯著低于CsA模型組(P<0.01)，且病理組織學檢查也顯示槲皮素干預性治療后腎小管損傷、腎間質(zhì)纖維化積分也明顯減輕，提示槲皮素可下調(diào)腎組織TGF-β1的表達、減輕慢性小管間質(zhì)纖維化進程從而發(fā)揮腎保護作用。在以往的實驗中也有學者證實槲皮素抗纖維化作用可能與下調(diào)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟組織中TGF-β1和CTGF的表達有關(guān)【13】。由于慢性環(huán)孢素腎病的發(fā)生機制較復雜，且致纖維化途徑相互影響，故對于槲皮素具體通過何種機制發(fā)揮其抗纖維化作用和延緩腎功能惡化有待進一步實驗證實。

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Protectiveeffectsofquercetinonchroniccyclosporinenephropathyinrats

Tanzhouke,Tangzhi,Luoqian,Yangyibin

(Department of Nephrology,the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo observe the effect of quercetin on cyclosporine A (CsA)-induced chronic renal tubulointerstitial injury through establishing rat chronic cyclosporine nephropathy.MethodsMale SD rats were given low-sodium diet for 1 week and then randomly divided into normal control,CsA model group (intragastric administration with CsA was dissolved in olive oil),quercetin treatment and solvent control groups (intragastric administration with olive oil) .CsA was dissolved in olive oil and intragastrically applied to induce chronic renal injury.Four weeks after quercetin treatment,rats were sacrificed and the body weight,serum creatinine and urinary protein were measured,respectively.Hematoxylin-eosin (HE) and Masson staining were performed to evaluate the morphological changes and renal tissue score.The transforming growth-β1 (TGF-β1) expression in renal tissue was detected by immunochemical assay.ResultsQuercetin treatment alleviated CsA-induced decrease of body weight and increase of serum creatinine and urinary protein.Compared with CsA group,tubulointerstitial injury with interstitial fibrosis and tubular atrophy was attenuated in quercetin treatment guoup.In addition,quercetin reduced CsA-induced TGF-β1 protein expression.ConclusionQuercetin could attenuate CsA-induced chronic renal injury and this effect might be in part related to decreasing urinary protein excretion,downregulating TGF-β1 expression and halting the progression of tubulointerstitial fibrosis.

quercetin;cyclosporine;chronic nephrotoxicity;tubulointerstitial fibrosis

貴州省教育廳自然科學基金項目(NO:黔教科2010044)。

楊亦彬，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：慢性腎臟病，E-mail:yyb1011@sina.com。

Q946.3;R392-33

A

1000-2715(2012)05-0396-04

【收稿2012-08-26；修回2012-09-15】

(編輯：譚秀榮)