王燕君，聞真珍，張 娥，譚志勇，王亞平，劉運權，劉 偉*

(1.東莞市農業(yè)種子研究所，廣東東莞 523063; 2.華南農業(yè)大學生命科學學院， 廣東廣州 510642)

硬葉兜蘭花芽SSH文庫的構建

王燕君1，聞真珍2，張 娥2，譚志勇1，王亞平1，劉運權2，劉 偉2*

(1.東莞市農業(yè)種子研究所，廣東東莞 523063; 2.華南農業(yè)大學生命科學學院， 廣東廣州 510642)

利用SMART策略構建了硬葉兜蘭花芽的抑制性消減雜交(SSH)文庫.通過PCR對文庫中插入的片段進行檢測后，篩選了288個插入片段為500 bp以上的克隆進行測序.測序結果去除載體序列后聚類得到18條差異表達片段，用BLAST進行比對分析表明，這些差異表達基因所編碼的蛋白涉及光合作用、合成代謝、基因調控等功能,其中，包括多個轉座子和反轉錄轉座子的同源基因.

硬葉兜蘭(Paphiopedilummicranthum)；抑制消減雜交(SSH)；花發(fā)育

兜蘭(Paphiopedilum)是蘭科植物中最具特色的一個類群，唇瓣呈兜狀,背萼發(fā)達，具有艷麗的花紋.兜蘭的兩枚能育雄蕊著生在蕊柱的兩側，發(fā)達的背萼呈扁圓形或倒心形，在各瓣中顯著.在觀賞兜蘭生產中，種苗生產和栽培技術都不完善，而花期調控問題也難于解決.

目前對兜蘭的研究集中在生理生態(tài)、栽培和繁殖技術等方面[1-4]，對其花發(fā)育的分子生物學研究尚為空白.本研究以硬葉兜蘭(Paphiopedilummicranthum)為材料，利用抑制性消減雜交技術(suppression subtractive hybridisation, SSH)，以花芽mRNA(tester，試驗方)及營養(yǎng)芽mRNA(driver，驅動方)為樣品，構建硬葉兜蘭花芽SSH文庫，分離與其花發(fā)育相關的差異表達基因片段，并對相關片段的功能進行初步分析，以期為闡明硬葉兜蘭花發(fā)育的分子機制提供重要的信息.

1 材料和方法

1.1材料

硬葉兜蘭栽培于華南農業(yè)大學生命科學學院溫室.于不同發(fā)育時期取其營養(yǎng)芽和花芽，-80℃冰箱中保存以備提取總RNA.

試劑和酶：SMARTTMcDNA Library Construction Kit為Clontech公司產品；焦碳酸二乙酯(DEPC)，MOPS，氨卞青霉素鈉鹽，TaqDNA聚合酶，各種限制性內切酶和T4 DNA Ligase均購自上海Sangon公司；其它試劑為國產分析純.

1.2方法

1.2.1 總RNA提取 總RNA采用Trizol法提取，利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，利用紫外分光光度法檢測質量和濃度.

1.2.2 cDNA合成及消減文庫的建立 采用Clontech公司的PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit中的試劑及反轉錄酶，合成雙鏈cDNA.以花芽為Tester，營養(yǎng)芽為Driver.按照試劑盒說明書將上述合成的雙鏈cDNA進行酶切、接頭連接和消減雜交，稀釋的雜交產物用primer1進行32個循環(huán)的第一輪PCR,產物稀釋后用巢式PCR引物進行32個循環(huán)的第二輪擴增.2輪擴增后得到的PCR產物經(jīng)過切膠回收純化后，連接到pMD18-T載體并轉化大腸桿菌DH5α，通過藍白斑篩選陽性克隆并計算轉化率.

1.2.3 消減效率的分析 分別以消減和未消減的樣品為模板，用上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′和下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′進行PCR擴增甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)基因，對18、23、28和33個循環(huán)的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)G3PDH基因表達量的變化分析所建文庫的消減效率.

1.2.4 測序及差異表達基因功能分析 挑取陽性克隆，用M13通用引物檢測插入片段.將插入片段大小為500 bp以上的克隆送到上海生工測序.其測序結果去除載體序列后，用DNAstar進行聚類，通過BLASTx比對分析，預測相應基因的功能及其與硬葉兜蘭花發(fā)育的關系.

2 結果與分析

2.1硬葉兜蘭營養(yǎng)芽和花芽總RNA質量檢測

電泳檢測結果表明，28S和18S rRNA條帶清晰，說明提取的總RNA完整(圖1).經(jīng)紫外分光光度檢測，得到營養(yǎng)芽總RNA樣品的OD260/OD280為1.89，花芽的為1.85，說明RNA純度較高，可用作后續(xù)反轉錄的模板.

M: DL2000 ladder; 1: total RNA extracted from vegetative buds; 2: total RNA extracted from floral buds.

圖1 硬葉兜蘭營養(yǎng)芽和花芽總RNA

Figure 1 Total RNA extracted from vegetative and floral buds ofP.micranthum

2.2cDNA合成及消減文庫質量檢測

合成的cDNA相對分子量大小分布于500～2 250 bp之間，呈均勻彌散狀態(tài)(圖2)，質量符合后續(xù)酶切實驗的要求.酶切后的花芽cDNA片段加上接頭，作為tester，未加接頭的營養(yǎng)芽cDNA片段為driver，雜交后的cDNA進行2輪PCR擴增.為分析消減效率，分別以消減及未消減PCR 產物為模板，用G3PDH引物進行PCR 擴增，分別對18、23、28和

M: 250bp DNA ladder; 1:double-strand cDNAs of vegetative buds; 2: double-strand cDNAs of vegetative buds

圖2 硬葉兜蘭營養(yǎng)芽和花芽雙鏈cDNA

Figure 2 Double-strand cDNAs of vegetative and floral buds ofP.micranthum

33個循環(huán)的PCR產物進行電泳分析，結果顯示：與未消減組PCR產物相比，消減組PCR產物中G3PDH 基因產物大大減少，說明所構建的消減文庫有一定的消減效率(圖3).

圖3 消減效率分析結果

經(jīng)過2輪PCR后，差異片段得到富集(圖4)，集中分布于750～1 500bp之間(圖4，Lane1).將第2輪PCR產物純化,轉化大腸桿菌DH5α后共獲得445個陽性克隆.選取其中320個陽性克隆，以M13通用引物進行PCR，電泳檢測出具有1個插入片段的克隆300個，陽性克隆率93.75%；其中插入的片段大小位于250～1 500 bp之間(圖5).

M: DL2000 ladder; 1:secondary PCR product after subtraction; 2: secondary PCR product of un-subtracted samples; 3:primary PCR product after subtraction; 4: primary PCR products of un-subtracted samples

圖4 消減PCR電泳檢測結果

Figure 4 Electrophoresis analysis of subtracted PCR products

圖5 文庫中部分陽性克隆PCR鑒定結果

Figure 5 PCR products of some randomly selected subtracted-library clones

2.3EST分析

EST結果見表1.在聚類后的18個EST序列中，3個沒有同源匹配基因，5個為未知功能的假定蛋白，其余具有同源序列的特異表達基因包括與植物細胞合成代謝相關的糖原合成酶基因、光合作用相關基因、基因調控信號途徑相關激酶基因以及與mRNA修飾相關的基因等.在同源序列比對中，有多個與反轉錄轉座子相關的同源序列，另外還包含1個轉座子序列和1個可作為分子標記的微衛(wèi)星序列.

表1 硬葉兜蘭花芽中特異表達的序列Table 1 Sequences expressed differentially in floral buds of P. micranthum

3 討論

SSH是一種以抑制PCR為基礎的cDNA 縮減雜交法，1999年BIRCH等[1]第一次將此技術成功運用于對馬鈴薯晚疫病的研究中.隨后，在蘭花特異基因的分離方面，研究者利用SSH技術成功獲得了文心蘭假鱗莖中的差異表達基因[2]、與萬代蘭(VandaMimi Palmer)香氣相關的基因[3]以及蝴蝶蘭唇瓣突變體中的差異表達基因[4]，本研究采用SMART cDNA 合成技術，利用沒有純化的硬葉兜蘭總RNA，成功的構建了硬葉兜蘭花芽的SSH文庫，在此基礎上分離得到的在花芽中特異表達的基因，將為研究硬葉兜蘭花發(fā)育的分子機理提供基礎.

花發(fā)育的分子機理是近二十多年來植物學領域的研究熱點，通過對模式植物擬南芥的研究，提出了植物開花的幾種途徑以及花器官發(fā)育的ABC模型[5].然而由于蘭花基因組信息的缺失及其轉化再生體系的不完善，蘭花花發(fā)育分子基礎的研究落后.研究者從蝴蝶蘭、文心蘭以及石斛蘭中克隆到了大量的與花發(fā)育相關的基因[6-8]，并在經(jīng)典的ABC模型的基礎上，針對蝴蝶蘭提出了蘭花花器官發(fā)育的分子調控模型，認為B類MADS-box基因在調控蘭花花器官的發(fā)育過程中起到關鍵作用[9].花期調控方面，已經(jīng)從石斛蘭、蝴蝶蘭等蘭花中分離到與調控花期相關的基因[6].然而兜蘭作為蘭花中具有極高觀賞價值的成員之一，由于資源的有限和栽培技術、再生體系的不完善，目前的研究大多集中于栽培和繁殖技術方面，對其花發(fā)育的研究沒有任何相關報道.但花期調控技術卻是栽培過程中亟需克服的難題，以硬葉兜蘭為例，人工引種栽培后很少開花，導致人工繁殖和育種都成為難題.本研究通過SSH文庫篩選硬葉兜蘭花芽中的差異表達基因，可以為研究其花發(fā)育機理提供基礎.但是由于兜蘭乃至蘭科植物基因組信息的缺失，以及現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中相關信息的匱乏，人們很難根據(jù)文庫中篩選得到的基因片段在網(wǎng)上搜索到其全部基因信息.因此，本研究中得到的差異表達片段有多數(shù)功能未能進行初步確定，需要進一步的實驗研究.

通過同源比對，初步確定功能的差異表達基因包括與植物細胞合成代謝相關的糖原合成酶基因和光合作用相關基因PsaB，另外還包括MAPK級聯(lián)信號通路中的MAPKKK激酶基因.植物中的MAPK級聯(lián)信號通路參與脅迫信號以及激素信號的傳導[9]，MAPKKK激酶基因在硬葉兜蘭花芽中的差異表達可能與激素信號的傳導相關.通過SSH文庫篩選到的差異表達基因包含一個與RNA剪切相關的基因，該基因的表達與轉錄后的調控相關.該基因在花芽中差異表達在硬葉兜蘭花發(fā)育過程中的功能有待進一步研究.

本研究分離的在硬葉兜蘭花芽中特異表達的基因中，含有多個轉座元件(Transposable elements，TEs)同源基因，其中包括轉座子、反轉錄轉座子以及轉座酶(表1).TE序列是基因組的重要組成部分，在水稻和擬南芥的基因組中，TE分別占29%[10]和10%[11].HSU等利用細菌人工染色體技術(BAC)對蝴蝶蘭的基因組序列進行分析表明，有23%的BESs(BAC end sequences)包括重復DNA序列，其中54.7%為反轉錄轉座子[12].擬南芥中7.8%的EST序列與TE具有同源性，這些基因的產物具有調節(jié)功能，但不具有結構蛋白的功能[13].TE可以在植物特定發(fā)育階段和特定組織中表達，參與發(fā)育調控.在花發(fā)育過程中，也存在TE的特異表達.在春化途徑關鍵基因BvFLC的上游存在2個反轉錄轉座子，DNA甲基化水平的降低可能促進這2個反轉錄轉座子的激活，從而影響下游BvFLC的表達，促進植株抽薹[14].本研究從硬葉兜蘭花芽中分離到的TE同源基因，可能參與硬葉兜蘭的花發(fā)育調控過程，其作用將深入研究，有助于進一步認識TE在植物發(fā)育中的調控功能.

[1] BIRCH P R J,AVROVA A O,DUNCAN J M,et al. Isolation of potato genes that are induced during an early stage of the hypersensitive response toPhytophthorainfestans[J]. Mol Plant Microbe In,1999,12(4):356-361.

[2] TAN J,WANG H L,YEH K W. Analysis of organ-specific, expressed genes inOncidiumorchid by subtractive expressed sequence tags library[J]. Biotechnol Lett, 2005,27:1517-1528.

[3] CHAN W S,ABDULLAH J O,NAMASIVAYAM P. Isolation, cloning and characterization of fragrance-related transcripts fromVandaMimi Palmer[J].Sci Hortic ulturae, 2011,127:388-397.

[4] CHEN Y H,TSAI Y J,HUANG J Z,et al.Transcription analysis of peloric mutants ofPhalaenopsisorchids derived from tissue culture[J].Cell Res,2005, 15(8):639-657.

[5] IRISH V F.The flowering ofArabidopsisflower development[J]. Planta, 2010,61:1014-1028.

[6] 陳小強,孫寧,劉玉芹，等.蘭花花發(fā)育的分子生物學研究[J].天津農學院學報,2011, 18(1):27-31.

[7] 王亞琴,鐘開新,陽成偉，等.石斛蘭SIZ1基因的克隆及序列分析[J].華南師范大學學報：自然科學版,2011(2):119-123.

[8] 梁山,陳莉莉,李洪清.基于金釵石斛EST的短串聯(lián)重復序列的挖掘[J]. 華南師范大學學報：自然科學版,2011(2):113-118.

[9] 陳婭斐,馮斌,趙小明，等.MAPK級聯(lián)途徑在植物信號傳導中的研究進展[J].植物學通報,2005,22(3):357-365.

[10] MESSING J,BHARTI A K,KARKIWSKI W M,et al.Sequence composition and genome organization of maize[J].PNAS,2004,101:14349-14354.

[11] ARABIDOPSIS G I. Analysis of the genome sequence of the flowering plantArabidopsisthaliana[J].Nature,2000,408:796-815.

[12] HSU C C, CHUNG Y L, LEE Y L, et al. An overview of thePhalaenopsisorchid genome by BAC end sequence analysis[J]. BMC Plant Biol, 2011, 11:3.

[13] LOCKTON S, GAUT B S. The contribution of transposable elements to expressed coding sequence inArabidopsisthaliana[J]. J Mol Evol, 2009, 68:80-89.

[14] TRAP-GENTIL M V, HéBRARD C, LAFON-PLACETTE C, et al. Time course and amplitude of DNA methylation in the shoot apical meristem are critical points for bolting induction in sugar beet and bolting tolerance between genotypes[J]. J Exp Bot, 2011, 62(8):2585-2597.

Keywords：Paphiopedilummicranthum; suppression subtractive hybridization (SSH); floral development

ConstructionofSuppressionSubtractiveHybridizationLibraryfromtheFloralBudsofPaphiopedilumMicranthum

WANG Yanjun1, WEN Zhenzhen2, ZHANG E2, TAN Zhiyong1, WANG Yaping1, LIU Yunquan2, LIU Wei2

(1. Institute of Agricultural Seeds, Dongguan 523063, China; 2. School of Life Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

With high ornamental and research value,Paphiopedilummicranthumis a species of the genusPaphiopedilumnative to China, which is endangered and protected intensively by the country. However, there are few reports on its floral development mechanism because of the supply shortage and backward cultivation technology. In this study, a suppression subtractive hybridization (SSH) library was constructed using the cDNAs from the floral and vegetative buds ofP.micranthumas the tester and the driver, respectively. The insert fragments were tested by PCR, and 288 clones with 500 bp or longer from the library were selected for sequencing. Totally, 18 ESTs were obtained, after vector sequences removed and clustered. The ESTs were functionally annotated by Blast. Those which matched significantly with Nr database were further classified into functional groups including photosynthesis, biosynthetic metabolism, gene regulation, etc. Among them, a few sequences with homology to transposons or retro-transposons were obtained. The genes differentially expressed in floral buds ofP.micranthumisolated in this study could make a base for investigating the molecular mechanism of floral development.

2011-08-31

廣東省科技計劃項目(2008B020400006)；廣東省良種培育和引進專項資金項目(2008-810)；東莞市高等院?？蒲袡C構科技計劃項目(2007108101107)

*通訊作者，liuwei@scau.edu.cn

1000-5463(2012)01-0099-04

Q945.4

A

【責任編輯 成 文】