毛征宇，萬(wàn)本愿，王文丁，陳 會(huì)，徐紅萍

(1、江西省人民醫(yī)院輸血科，江西 南昌 330006；2、江西省臨床檢驗(yàn)中心，江西 南昌 330006；3、江西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006)

準(zhǔn)確鑒定血型是保證臨床輸血安全、防止重大醫(yī)療事故發(fā)生的重要保證。常規(guī)應(yīng)用的ABO血型血清學(xué)正反定型技術(shù)，具有簡(jiǎn)單實(shí)用的特點(diǎn)，但亦存在一定的局限性，而基因分型的方法在某種程度上克服了血清學(xué)實(shí)驗(yàn)的弱點(diǎn)，可以作為血清學(xué)方法的有益補(bǔ)充。本研究采用血清學(xué)和PCRSSP法兩種方法對(duì)比鑒定ABO血型，旨在江西地區(qū)臨床輸血工作中，建立起穩(wěn)定的PCR-SSP基因分型方法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2006年10月至2011年10月，隨機(jī)選取江西地區(qū)健康漢族無(wú)關(guān)個(gè)體100例，年齡18～55歲。抽取靜脈血3ml并EDTA抗凝。

1.2 試劑抗A、抗B血型定型試劑(北京金豪制藥股份有限公司)，AC、BC、OC及正反定型微柱凝膠卡(長(zhǎng)春博訊生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，ABO基因分型試劑盒(美國(guó)G&T公司)，基因組DNA提取試劑盒、Taq酶和 Marker(TaKaRa公司)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 DNA提取嚴(yán)格按TaKaRa公司試劑盒說(shuō)明書的要求進(jìn)行操作。抽提完成后，取10μl DNA溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，于紫外燈下觀察結(jié)果，并使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD值然后計(jì)算濃度(UV752N型紫外分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司)，DNA終濃度調(diào)節(jié)至40～70ng/μl。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系的總體積為9μl，包含1μl DNA樣品，1μl Taq酶 (預(yù)先經(jīng) 15倍稀釋，0.33-0.5U)，基本引物 Mix-A、Mix-A201、Mix-B和Mix-O的混合液7μl。PCR擴(kuò)增條件(1000-Series Thermal Cyclers型PCR儀，美國(guó)Bio-rad公司)：預(yù)變性 95℃ 5min→變性 95℃ 30s→退火 60℃30s→延伸72℃ 90s(30個(gè)循環(huán))→終末延伸72℃5min→保溫4℃。

1.3.3 PCR產(chǎn)物的電泳分析 PCR產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，以100V電壓電泳25min后紫外燈下觀察條帶，擴(kuò)增條帶與內(nèi)對(duì)照207bp(人生長(zhǎng)激素基因，hGH)及DL 500 DNA Marker相比較并讀取結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)中拍照記錄(Uvipro型凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3.4 結(jié)果判斷 根據(jù)是否產(chǎn)生特異性目的片段以及片段的長(zhǎng)度大小來(lái)確定基因分型，判讀標(biāo)準(zhǔn)和基因分型格局如表1、表2所示。

1.3.5 血清學(xué)分型方法 正反定型凝膠微柱法和鹽水凝集試管法，操作過(guò)程和判讀標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[1]。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)分型結(jié)果 采用ABO血型凝膠微柱卡和鹽水凝集試管法對(duì)100例江西地區(qū)健康漢族無(wú)關(guān)個(gè)體進(jìn)行血清學(xué)分型，檢測(cè)出A型32例(32.0%)，B 型 24 例(24.0%)，AB 型 8 例(8.0%)，O 型36例 (36.0%)。計(jì)算其基因頻率可知：A基因?yàn)?.2253，B 基因?yàn)?0.1753，O 基因?yàn)?0.5998。

表1 ABO基因分型的判讀參數(shù)

表2 基因分型的電泳格局

2.2 PCR-SSP法基因分型結(jié)果 采用PCR-SSP法進(jìn)行基因分型，共檢出4種等位基因(即A、B、O和A201)9種基因型：A/O 型14例(14.0%)，A/A201型11例 (10.0%)，A201/O 型 6例 (6.0%)，A/A 型 1 例(1.0%)，B/O 型 17 例(17.0%)，B/B 型 7 例(7.0%)，A/B 型 5例(5.0%)，A201/B 型 3例(3.0%)，O/O 型 36例(36.0%)?；蚍中徒Y(jié)果與血清學(xué)分型結(jié)果一致。

3 討論

ABO血型基因分型技術(shù)在國(guó)內(nèi)外進(jìn)展迅速，甚至有國(guó)外學(xué)者撰文探討對(duì)于具有百年歷史的凝集試驗(yàn)是否該說(shuō)“再見(jiàn)”[2]。我們采用血清學(xué)和基因分型兩種方法對(duì)100名江西健康漢族個(gè)體進(jìn)行血型鑒定，結(jié)果顯示：血清學(xué)分型與基因分型結(jié)果一致，江西地區(qū)人群以O(shè)型為多，基因頻率的分布：A基因?yàn)?.2253，B基因?yàn)?.1753，O基因?yàn)?.5998，這與我國(guó)漢族人群的分布情況基本吻合，同時(shí)也符合ABO血型在中國(guó)分布特點(diǎn)的推斷[3]：從北向南方向，B基因頻率逐漸下降，而O基因頻率升高，云、貴、川和長(zhǎng)江中下游地區(qū)A基因頻率升高。

隨著輸血學(xué)和組織、器官移植技術(shù)的研究發(fā)展，傳統(tǒng)血清學(xué)方法的若干不足也逐漸暴露出來(lái)[4]。對(duì)于亞型和變異型、特殊疾病導(dǎo)致的抗原表達(dá)異常(白血病、腫瘤等)[5]、細(xì)菌污染或血漿蛋白紊亂導(dǎo)致的弱凝集或假凝集、不規(guī)則抗體和自身抗體等情況的分辨率不高，往往需要進(jìn)行抗人球蛋白試驗(yàn)、吸收放散實(shí)驗(yàn)、唾液物質(zhì)鑒定等額外的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)；結(jié)果判讀的主觀性較大，不同實(shí)驗(yàn)室甚至不同實(shí)驗(yàn)人員之間的結(jié)果可比性不強(qiáng)；試劑的質(zhì)量對(duì)于鑒定結(jié)果有決定性影響等[6，7]。然而運(yùn)用基因分型技術(shù)進(jìn)行ABO血型鑒定，克服了血清學(xué)方法易受抗原活性竟?fàn)?、抗體的特異性及微生物污染等因素的影響的缺點(diǎn)，不需要做繁雜的一系列血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，并且，正反定型、吸收放散實(shí)驗(yàn)、鹽水凝集試管法、抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)等血清學(xué)方法只能鑒定表型，而基因分型技術(shù)則可以直接確定ABO血型基因型，有效的解決了疑難血型鑒定難的問(wèn)題，所以說(shuō)，基因分型技術(shù)不但可以補(bǔ)充血清學(xué)方法的不足，對(duì)于疑難血型的正確診斷也有重要作用，對(duì)臨床輸血醫(yī)學(xué)水平的提高有很大的意義[8]。

[1]葉應(yīng)嫵,王毓三,申子瑜.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].第3版.南京:東南大學(xué)出版社,2006,246-256.

[2]趙桐茂,人類血型分型的新紀(jì)元[J].中國(guó)輸血雜志,2007,20(1):1-2.

[3]陳稚勇,趙桐茂,張工梁.中國(guó)人ABO血型分布[J].遺傳,1982,4(2):4-7.

[4]周炳能.29例ABO血型正反定型不一致原因探討[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2010,28(2):189-190.

[5]吳敏華,陳活強(qiáng),蔡葵.惡性血液病引起ABO血型鑒定困難的探討[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2008,26(6):690-692.

[6]嚴(yán)建新,陳敏霞.浙江沿海地區(qū)漢族人A型及AB型血型的基因亞型研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2010,20(2):341-344.

[7]雷國(guó)華,鐘清蘭,熊永萍,等.微柱凝膠免疫檢測(cè)法在配血及血型鑒定中的應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2010,28(2):202-204.

[8]黃新寶,鞠海英.基因分型在正反定型不符病例中的診斷意義[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2011,15(7):1211-1212.