簡正偉綜述，萬臘根審校

(南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006)

微小RNA(miRNAs,miR)為一類長度約21～22核苷酸(nucleotide,nt)的單鏈非編碼小RNA分子。1993年Lee等[1]首次在線蟲體內發(fā)現(xiàn)第一個miRNA(lin-4)，能在翻譯水平通過抑制核蛋白lin-14的表達來調節(jié)線蟲的幼蟲發(fā)育進程。一系列的研究表明，miRNA在機體正常發(fā)育、分化、生長及凋亡中發(fā)揮重要的作用，如胚胎發(fā)育、細胞生長和凋亡、血細胞分化、神經元的極性、胰島素分泌、大腦形態(tài)形成、心臟發(fā)生和脂肪代謝等，隨著研究的進展，對miRNA的研究從量的表象變化已經慢慢過渡到作用機制，從此揭開了科研工作者對此類體內廣泛存在的基因調控方式研究的序幕[2]。據(jù)報道人類細胞中已經發(fā)現(xiàn)的miRNA已達幾百余種，通過全世界科學家的不懈努力，已經成功構建了miRNA數(shù)據(jù)庫。據(jù)科學家推測人類基因組中大約存在著1000余種miRNA，雖然它僅占總編碼RNA基因數(shù)量的1%，但它卻能調控著人類基因組約占30%的蛋白質編碼基因的表達,在基因調節(jié)中具有不可替代的作用[3]。

1 miRNA的生物學作用

miRNA由基因組DNA編碼，通過RNA聚合酶Ⅱ協(xié)助轉錄產生初始的miRNA—Pri-miRNA，Pri-miRNA在核內被RNA酶III家族成員Drosha加工成一個70nt左右具發(fā)夾結構的單鏈RNA前體(Pre-miRNA)，即miRNA的前體。Pre-miRNA再與雙鏈RNA結合蛋白DGCR8結合。然后在小分子單體G蛋白依賴的轉運受體exportin-5作用下，轉運至細胞漿中。在RNA酶III家族酶Dicer的切割作用下產生約22nt左右的成熟miRNA。隨后成熟的miRNA雙鏈解旋，其中的一條成熟單鏈結合到RNA誘導沉默復合物中，通過與靶mRNA特異性堿基配對的方式，與目標mRNA的3'-UTR區(qū)互補配對，引起翻譯的抑制或mRNA的降解[4]。當它與mRNA完全互補配對時，miRNA的作用方式和RNA干擾相似，即與完全互補的同源mRNA配對結合，導致mRNA切割或降解；當它與mRNA不完全互補配對時，則會阻遏轉錄后翻譯[5]。其結果導致相應蛋白質合成的減少或缺失，從而導致疾病的發(fā)生。

2 miRNA在腫瘤中的作用

隨著人們對miRNA認識和了解,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)它與腫瘤的形成有著密切的關系，大部分的miRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關的脆性位點(fragile-site)上，miRNA通過調控靶基因參與的信號通路，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展,發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的功能。說明miRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著至關重要的作用。有些miRNA在腫瘤中過表達可以被看作“致癌基因”，它們通過負性調節(jié)抑癌基因或控制細胞分化和凋亡基因的作用，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如miR-21[6]。有些在腫瘤中表達減低miRNA可以被看作 “抑癌基因”，抑癌miRNA通過調節(jié)抑癌基因或控制細胞分化和凋亡基因的作用，從而抑制或者延緩腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如miRNA-145[7]。越來越多的研究表明，miRNA參與了包括結腸直腸癌、垂體腺瘤、肺癌、宮頸癌、肝癌、甲狀腺癌、胰腺癌、神經母細胞瘤、白血病以及乳腺癌等在內的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。

乳腺癌是目前女性最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)資料統(tǒng)計，發(fā)病率約占全身各種惡性腫瘤的7%-10%，在婦女中僅次于子宮癌的一種全身性的惡性疾病。乳腺癌在美國每年新增病例約18萬例，死亡約4萬余例，是僅次于肺癌的一種惡性疾病。在我國乳腺癌的發(fā)病也呈逐年上升趨勢。目前研究發(fā)現(xiàn)，有多種miRNA在乳腺癌中有不同形式的表達。

3 在乳腺癌中起到致癌基因作用的miRNA

在乳腺癌中起到致癌基因作用的miRNA見表1,其中作用機制研究比較清楚的有miR-21、miR-155、miR-10b。

表1 乳腺癌中起到致癌基因作用的miRNA

3.1 miR-21

miR-21已經被發(fā)現(xiàn)在多種實體瘤中高度表達，包括乳腺癌[8]。Si ML等用RT-PCR的方法分析157種人類miRNA，比較正常乳腺組織和乳腺癌組織，結果發(fā)現(xiàn)miR-21在乳腺癌病人中高度表達。為了更好的驗證這一結果，作者用抗miR-21寡核苷酸轉染乳腺癌MCF-7細胞，結果發(fā)現(xiàn)抗miR-21寡核苷酸在體外抑制細胞生長，在異種移植的小鼠中抑制腫瘤生長。同時抗miR-21寡核苷酸能夠增加凋亡和減少細胞增殖[9]。

研究表明miR-21的作用靶點主要包括以下幾點：(1)PTEN(phosphatase and tensin homolog),它是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因，也是繼p53基因后另一個較為廣泛地與腫瘤發(fā)生關系密切的基因。PTEN通過去磷酸化作用參與細胞調控，從而調節(jié)細胞循環(huán)Akt和p53的活性。研究發(fā)現(xiàn)高濃度的miR-21可抑制PTEN基因，導致腫瘤的增殖、轉移和侵入到其他組織[10]。(2)PDCD4(programmed cell death 4)是近年新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，它的表達產物通過抑制相關基因的轉錄和翻譯，從而抑制腫瘤生成。目前已有多項研究報道了PDCD4有可能成為miR-21潛在的靶點之一，他們發(fā)現(xiàn)miR-21在多種腫瘤細胞中過表達，可直接結合TPM1，提示PDCD4有可能成為miR-21的靶基因，miR-21可以通過抑制PDCD4的表達從而促進癌癥的發(fā)生[11]。(3)TPM1(tropomyosin 1)被認為可以抑制腫瘤的惡性表型。Zhu S等[12]通過實驗證明TPM1也是在miR-21的3'-UTR區(qū)抑制其表達,而在使用了抗miR-21藥物的腫瘤患者中TPM1的表達增加。此外，有研究發(fā)現(xiàn)Maspin也有可能是miR-21的作用靶基因[13]。這些基因通過負性調節(jié)作用于乳腺癌細胞系，提示miR-21有可能是通過多重抗轉移靶基因作用促進腫瘤的侵潤和轉移。

3.2 miR-155

miR-155在人類多種腫瘤中高度表達，包括乳腺癌[9]。第一次發(fā)現(xiàn)miR-155作為人類腫瘤致癌基因是在B細胞性淋巴瘤和慢性淋巴性白血病中高表達[14]。Iorio等采用微陣列和Northern印跡方法發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，miR-155在乳腺癌組織中高表達從幾倍到幾十倍。這在之前的研究中也被證實，在正常組織、癌旁組織及腫瘤組織中miR-155的表達量呈現(xiàn)遞增趨勢[15]。研究發(fā)現(xiàn)miR-155通過TGF-β/Smad4路徑在正常小鼠上皮細胞中高表達，并且調解TGF-β，從而誘導上皮間葉細胞轉化和侵入[16]。為了驗證miR-155是否具有介導TGF-β誘導上皮間葉細胞轉化的作用，作者發(fā)現(xiàn)miR-155在正常小鼠上皮細胞中的異位表達能夠破壞細胞間緊密連接和促進細胞的轉移。相反抗miR-155在正常小鼠上皮細胞中能夠減低TGF-β誘導上皮間葉細胞轉化作用。此外miR-155還直接抑制RhoA基因的表達。RhoA是一種調節(jié)多種細胞進程的基因，它在細胞交叉點的形成和穩(wěn)定性方面起著很重要的作用。此外，Jiang S等研究發(fā)現(xiàn)SOCS1可能作為miR-155在乳腺癌細胞的靶向基因[17]。作者通過Western blot分析發(fā)現(xiàn)與正常對照相比，SOCS1蛋白水平在miR-155高度表達的乳腺癌細胞MCF-7中降低3倍。通過qRT-PCR分析，當miR-155高度表達16倍時，SOCS1 mRNA水平降低30%左右；當用乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞系去敲除miR-155的表達時，發(fā)現(xiàn)SOCS1蛋白表達水平增加5倍。提示SOCS1基因有可能是miR-155作用于乳腺癌細胞的靶向基因。

3.3 miR-10b

Ma等[18]在研究中發(fā)現(xiàn)miR-10b在乳腺癌組織中高表達，在轉移的乳腺癌組織及轉移性乳腺癌細胞株中的表達升高更明顯,在高轉移能力的MDA-MB-231和SUM1315細胞株中miR-10b表達量比正常乳腺上皮細胞高50倍以上。相反,在非轉移性乳腺癌細胞株SUM149、SUM159和MCF-7比正常乳腺上皮細胞表達低。Ma等發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞系中Twist1作為一種促進轉移的轉錄因子,通過與miR-10b發(fā)夾結構的上游框架結合，從而激活啟動區(qū)來調控miR-10b的轉錄水平；而miR-10b通過調控阻遏抑癌蛋白HOXD10 mRNA的翻譯，繼而提高細胞轉移蛋白RHOC的表達水平。提示 miR-10b有可能是通過 Twist–miR-10b–HOXD10–RhoC路徑來調節(jié)腫瘤的轉移和侵襲能力。

4 在乳腺癌中起到抑癌基因作用的miRNA

在乳腺癌中起到抑癌基因作用的miRNA見表2,其中作用機制研究比較清楚的有miR-206、miR-145、miR-31。

4.1 miR-206

表2 乳腺癌中起抑癌基因作用的miRNA

Iorio MV等利用miRNA微陣列方法比較正常乳腺組織和乳腺癌組織的miRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-206有可能作為乳腺癌的抑制基因[15]。Adams BD等研究發(fā)現(xiàn)miR-206在雌激素陰性的乳腺癌中高表達，它的調節(jié)機制是通過miR-206調節(jié)雌激素受體基因ESR1來實現(xiàn)的。最近研究發(fā)現(xiàn)miR-206通過在ESR1的3'-UTR區(qū)的兩個結合位點來抑制ESR1信使RNA的表達[19]。Kondo N等通過RT-PCR方法分析發(fā)現(xiàn)miR-206在ERa陽性的乳腺癌組織中低表達[20]。進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-206只與雌激素受體α陰性的乳腺癌成比例關系，而與雌激素受體β陰性的乳腺癌不成比例關系。劉浩等通過轉染miR-206到MDA-MB-231乳腺癌細胞中，48h后Western blot檢測轉染后乳腺癌細胞中Cdc42蛋白質表達，結果發(fā)現(xiàn)miR-206能抑制MDA-MB-231細胞中Cdc42蛋白質的表達和細胞絲狀偽足的形成,并且能抑制細胞的侵襲遷移能力[21]。

4.2 miR-145

miR-145在胃癌、膀胱癌、腸癌等多種癌癥中已經有報道顯示顯著下調。顧吉軼等采用一個臨床正常乳腺組織(NC)作為對照檢測了6例乳腺癌組織和6種乳腺癌細胞系 (MCF-7，ZR-75-30，T47D，MDA-MB-231，MDA-MB-453 ，MDA-MB-435)中miR-145的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)miR-145在癌組織和癌細胞系中均顯著下調，并且具有非常相似的表達模式[22]。miR-145的顯著下調表達提示miR-145有可能在腫瘤發(fā)生過程中起著非常重要的作用。miR-145轉染到MCF-7和MDA-MB-231細胞中，轉染過miR-145細胞的侵襲能力都要遠遠低于轉染陰性對照的細胞，細胞數(shù)均降低一半以上，這說明miR-145的確對乳腺癌細胞的侵襲有明顯的抑制作用。Wang S等通過比較乳腺癌細胞和正常乳腺細胞中miR-145表達含量，結果發(fā)現(xiàn)miR-145在乳腺癌細胞MCF-7中低表達，而在正常的乳腺細胞MCF10A中沒有低表達。高表達的miR-145能夠抑制MCF-7細胞的生長[23]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在MCF-7細胞中高表達的miR-145能夠降低RTKN蛋白的表達。失調的RTKN能夠抑制MCF-7細胞的生長，說明miR-145有可能是通過RTKN抑制乳腺癌細胞的生長。此外，Sachdeva M等轉染miR-145到轉移性乳腺癌細胞系MDA-MB-231和LM2-4142中，分別能降低細胞侵入50%和75%左右。而反義miR-145則能夠提高細胞侵入大約50%[24]。通過比較Western blot和免疫熒光分析miR-145在MUC1基因蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-145抑制細胞侵入和轉移是直接通過MUC1基因來實現(xiàn)的。

4.3 miR-31

美國科學家Valastyan S等發(fā)現(xiàn)microRNA-31(miR-31)可同時協(xié)調抑制多種靶基因，從而能夠同時參與腫瘤侵襲到轉移的多個步驟中。作者通過檢查15個人類和小鼠乳腺細胞系中的microRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-31在正常乳腺細胞中能夠表達，在非轉移乳腺細胞系的表達輕微減少，在轉移性乳腺癌細胞系中表達顯著減少。說明miR-31的表達有可能與人類乳腺癌患者的腫瘤轉移呈負向聯(lián)系，而在轉移性乳腺癌細胞系中呈低度表達[25]。另外，有數(shù)據(jù)顯示miR-31抑制轉移的能力很大一部分應歸于它抑制RhoA的能力，RhoA的再表達可部分翻轉miR-31的轉移抑制作用。為了進一步了解miR-31抑制癌基因的作用機制，作者使用 (PicTar和TargetScan)2種預測miRNA的靶mRNA計算方法，搜索與miR-31相關效應的靶基因。結果發(fā)現(xiàn)這些靶基因中的絕大多數(shù)是編碼與細胞運動過程相關的蛋白，miR-31直接調節(jié)了人類 乳 腺 癌 細 胞 內 源 性 的 Fzd3、ITGA5、M-RIP、MMP16、RDX和RhoA表達。只有當多個靶基因同時受到抑制時，miR-31才能顯現(xiàn)出最大地抑制轉移的能力。所以miR-31抑制乳腺癌細胞轉移是多基因共同作用的結果。

5 展望

近些年，對新型出現(xiàn)的miRNA在乳腺癌中的發(fā)病機制有了比較深入的了解。各種miRNA在具備相應的生物學特征(如Her2、ER、PR)的乳腺癌正常組織、癌旁組織和癌組織之間研究都比較深入。但是miRNA怎樣影響乳腺癌失調的機理，是否改變miRNA的表達就能夠改變乳腺癌的病理變化，失調的miRNA怎樣影響乳腺腫瘤的轉移能力仍然不是很清楚。能夠早期發(fā)現(xiàn)腫瘤轉移的敏感性和特異性都很高的miRNA將是我們不斷努力的方向。雖然miRNA作為腫瘤的靶向治療已經取得了一定的進展，但真正能夠很好地運用到臨床還有一段很長的路要走。

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