張興燦，趙聲蘭，葛 鋒，劉迪秋，韓本勇，陳 菱，陳朝銀，*

（1.昆明理工大學(xué)，云南昆明650224；2.云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明650200）

微波加熱在水解核桃蛋白中的研究

張興燦1，趙聲蘭2，葛 鋒1，劉迪秋1，韓本勇1，陳 菱2，陳朝銀1，*

（1.昆明理工大學(xué)，云南昆明650224；2.云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明650200）

對照研究微波加熱和水浴加熱條件下，蛋白酶水解核桃分離蛋白的效果差別，并以水解度評價指標(biāo)，確定了微波加熱條件下單酶水解的最佳工藝。實驗結(jié)果表明：微波加熱可以大大提高核桃蛋白的水解速度，微波加熱只需不到10min的時間即可達(dá)到所需的效果，而水浴加熱則需要2h的反應(yīng)時間，因此微波加熱可以明顯地縮短反應(yīng)時間，同時還發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶的水解效果優(yōu)于木瓜蛋白酶。

微波，核桃蛋白，水解度

蛋白酶具有專一性，不同蛋白酶對同一種蛋白質(zhì)底物的作用結(jié)果不同，水解產(chǎn)物中多肽的長度及結(jié)構(gòu)組成也不同，因此水解產(chǎn)物中抗氧化肽的含量、組成、活性強弱不同，且不同蛋白酶水解同一底物時，因其作用位點不同，也會影響其水解速率[1]。植物蛋白酶如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶等由于原料豐富，生產(chǎn)工藝簡單，價格低廉，并且生產(chǎn)的核桃肽產(chǎn)品風(fēng)味較好，應(yīng)用于核桃肽的生產(chǎn)有著獨特優(yōu)勢[2]。微生物蛋白酶隨著工程菌的應(yīng)用和發(fā)酵產(chǎn)酶效率的逐年提高，為大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用創(chuàng)造了條件，也非常適合于核桃肽的生產(chǎn)[3]。因酶法生產(chǎn)生物活性肽具有生產(chǎn)條件溫和、安全性高、專一性較強、副產(chǎn)物少、價格低廉且可得到特定的活性肽等優(yōu)點，其成為生產(chǎn)活性肽的主流方法[4]。目前對核桃蛋白酶解的研究逐漸增多，其中優(yōu)化酶解工藝，尋求一種可靠高效的水解流程成為許多學(xué)者研究的課題。常規(guī)的酶解反應(yīng)需要在水浴中進(jìn)行，時間長，費時費力。近年來人們嘗試通過使用各種物理輔助手段來縮短酶解時間，提高酶解效率。微波作為一種常用的物理輔助手段，由于環(huán)保無污染等特點，其應(yīng)用范圍不斷擴大[1]。本實驗以核桃分離蛋白為原料，以微波輔助酶解技術(shù)為手段，研究了木瓜蛋白酶和中性蛋白酶分別在水浴加熱和微波加熱下水解核桃分離蛋白的效果，并確定最優(yōu)化水解工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃分離蛋白 實驗室自制，蛋白質(zhì)含量≥75%；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司，食品級，酶活力為100000U/g；氫氧化鈉 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，分析純；鹽酸 廣州東紅化工廠，分析純。

美的微波爐 佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司，MM721AAU-PW型；精密pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司，雷磁PHS-3C型；紫外可見光分光光度計 Amersham Biosciences，Ultrospec 2100 pro；恒溫水浴鍋 鄭州長城科工貿(mào)有限公司，HH-S型；電子天平 上海天平儀器廠，F(xiàn)A2104型。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗操作 配制一定濃度的核桃蛋白溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH，加入一定量的酶，微波加熱反應(yīng)一段時間，取出沸水浴中加熱使酶失活，然后按1.2.2測定核桃蛋白的水解度，并以水解度為主要指標(biāo)，判定影響核桃蛋白水解主要因素的最佳水平。

1.2.2 水解度的測定 傳統(tǒng)的水浴加熱條件下，因反應(yīng)時間周期較長，可以采用及時補堿液使酶解過程中pH的波動在相對理想的范圍內(nèi)，進(jìn)而根據(jù)最后消耗的堿液量計算水解度。但是在微波加熱條件下，一方面因其時間較短；另一方面，微波爐是一個封閉的環(huán)境，在反應(yīng)的過程中加堿液不方便操作，因此在反應(yīng)結(jié)束后補加堿液來計算水解度。酶解反應(yīng)結(jié)束后加入0.05mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至反應(yīng)溶液初始pH，依據(jù)消耗的0.05mol/L NaOH溶液的量計算水解度。

水解度的計算采用pH—Stat[5]方法，按下式計算：

式中：V（NaOH）：水解過程中消耗的NaOH量，mL；Mp：蛋白質(zhì)總量；a：α氨基酸的解離度；h：每克蛋白質(zhì)中肽鍵物質(zhì)的量（取2.18）。

氨基的解離度按下式計算：

式中：pK：a氨基的解離常數(shù)，一般以7.0為平均值進(jìn)行計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物濃度對水解度的影響

分別精密稱取一定量的核桃蛋白溶于10mL去離子水中，配制一系列濃度的底物溶液，調(diào)節(jié)底物溶液pH至7.0（中性蛋白酶實驗時調(diào)pH至8.0），然后按照酶活與底物含量之比為5000U/g，加入一定量的酶，在微波爐內(nèi)反應(yīng)5min后，取出于沸水浴中滅酶10min，冷卻后測定水解度，并繪制底物濃度與水解度的關(guān)系圖，同時做水浴加熱條件下的平行實驗，結(jié)果見圖1。

圖1 底物濃度對核桃蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of concentration of substrate on degree of hydrolysis

底物濃度對水解影響較大，當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r，酶與底物蛋白質(zhì)分子接觸幾率少，生成的小分子肽產(chǎn)率低；但底物濃度太大時，蛋白質(zhì)分子會通過疏水作用和二硫健作用，形成網(wǎng)狀聚合體，反而降低酶解效率[6]。因此選擇適當(dāng)?shù)牡孜餄舛扔欣诿杆夥磻?yīng)的進(jìn)行。

從圖1中可知，微波加熱下的水解效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于水浴加熱，如在5%底物濃度下，木瓜蛋白酶在水浴加熱條件下的水解度約為3%，而在微波加熱條件下的水解度為15%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于水浴加熱條件下的水解效果；中性蛋白酶的水解效果則要好于木瓜蛋白酶。剛開始隨著底物濃度的增加，水解度先呈上升趨勢，但是在達(dá)到一定的底物濃度后，這種趨勢便趨于平緩，因此出于最佳條件的選擇，對于木瓜蛋白酶，最適底物濃度為5%，而中性蛋白酶為6%。

2.2 pH對水解度的影響

對于木瓜蛋白酶，配制一系列底物濃度為5%的核桃蛋白溶液；對于中性蛋白酶，配制一系列底物濃度為6%的核桃蛋白溶液，其他條件按2.1不變，考察pH對水解度的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 pH對核桃蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of pH on degree of hydrolysis

溶液pH是決定酶催化活性的重要參數(shù)之一。酶是一種特殊的蛋白質(zhì)，其分子構(gòu)象和解離狀態(tài)及底物分子的解離狀態(tài)會隨著環(huán)境pH的變化而變化，從而影響酶分子與底物的結(jié)合和催化，因此pH過高或過低均對酶水解反應(yīng)產(chǎn)生不利影響。從圖2可知，開始階段，隨著pH的增加，水解度也隨之增加，對于木瓜蛋白酶，pH7.0時水解度達(dá)最大值，pH繼續(xù)增加，水解度呈下降趨勢。中性蛋白酶則在pH9.0時水解度達(dá)最大值，pH繼續(xù)增加，水解度呈下降趨勢。從圖中得知，中性蛋白酶的水解效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于木瓜蛋白酶，微波加熱的水解效果則要優(yōu)于水浴加熱。

2.3 酶濃度對水解度的影響

對于木瓜蛋白酶，配制一系列底物濃度為5%的核桃蛋白溶液；對于中性蛋白酶，配制一系列底物濃度為6%的核桃蛋白溶液，其他條件按2.1不變，考察酶濃度對水解度的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同蛋白酶酶濃度對核桃蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of E/S on degree of hydrolysis

在底物濃度一定時，底物的水解效率取決于酶用量，酶用量越大，酶的催化位點與蛋白分子相應(yīng)位點接觸幾率越多，水解液中游離的氨基氮含量越高。當(dāng)這些位點快全部斷裂時，即使繼續(xù)加入酶，肽鍵斷裂數(shù)目增加緩慢[7]。

從圖3中可知，核桃蛋白水解度隨著酶濃度的升高會持續(xù)增加，但增加的速度是不一樣的，在E/S低于6000U/g時，隨著酶濃度的增加，核桃蛋白水解度增加的幅度較大；但當(dāng)E/S高于6000U/g以后，核桃蛋白水解度增加的速度減慢。從圖中同樣也可以看出，微波加熱的水解效果要優(yōu)于水浴加熱，中性蛋白酶的水解效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于木瓜蛋白酶。

2.4 反應(yīng)時間與水解度的關(guān)系

對于木瓜蛋白酶在pH7.0（中性蛋白酶的條件則為pH9.0），酶用量均為E/S=6000U/g，木瓜蛋白酶的底物濃度為5%，中性蛋白酶的底物濃度為6%，考察微波作用時間對水解的影響，結(jié)果見圖4。

微波加熱輔助酶解蛋白質(zhì)技術(shù)的最大特點是瞬時加熱，使得酶促反應(yīng)在短時間內(nèi)迅速完成。由圖4可知，當(dāng)酶用量一定時，水解時間愈長，水解效果愈好，但達(dá)到一定時間后，遞增速度變得緩慢。微波加熱時，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)液溫度持續(xù)升高，因此核桃蛋白的水解度也跟著增加，但是5min以后，反應(yīng)液的溫度已經(jīng)過高，酶的活性受到抑制，反應(yīng)速度開始減慢。對比研究圖4不難看出，微波加熱相對于水浴加熱最大的優(yōu)勢就是在較短的時間內(nèi)即可達(dá)到較高的水解度，利用微波加熱只需5min左右的時間就可以達(dá)到水浴加熱條件下200min才能達(dá)到的水解度，因此將微波加熱技術(shù)應(yīng)用于核桃蛋白肽的生產(chǎn)，可以大大提高水解速度約10～40倍。姜莉[8]采用木瓜蛋白酶水解自制的核桃蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶的水解度為9%，本實驗中在微波加熱條件下加熱5min，水解效果即可達(dá)到15%，高于其實驗效果。

圖4 核桃蛋白水解度隨酶解時間的變化關(guān)系曲線Fig.4 Effect of time on degree of hydrolysis

3 結(jié)論

3.1 初步確定了木瓜蛋白酶和中性蛋白酶對核桃蛋白的較佳水解條件分別是：木瓜蛋白酶：酶和底物之比為6000U/g，pH7.0，底物濃度為5%，水解時間為5min；中性蛋白酶：酶和底物之比為6000U/g，pH9.0，底物濃度為6%，水解時間為6min。

3.2 同等條件下中性蛋白酶的水解效果較木瓜蛋白酶好。

3.3 微波加熱相對于水浴加熱最大的優(yōu)勢是在較短的時間內(nèi)就可以達(dá)到較高的水解度，利用微波加熱只需5min左右的時間就可以達(dá)到水浴加熱條件下200min才能達(dá)到的水解度，這對提高生產(chǎn)力水平具有重要意義。

[1]李菊芳，董緒燕，魏芳，等.微波/超聲波及固定化酶技術(shù)在食品蛋白質(zhì)高效水解中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2009，11（6）：86－92.

[2]張樹政.酶制劑工業(yè)（下冊）[M].北京：科學(xué)出版社，1986：387.

[3]郭杰炎，蔡武城.微生物酶[M].北京：科學(xué)出版社，1986：246.

[4]JFeng YL Xing.Interaction and functionality of mixed myofibililax and enzyme－h(huán)ydrolyzed soy proteins[J].Journal of Food Science，2003，68（3）：803－809.

[5]袁斌，呂桂善，劉小玲.蛋白質(zhì)水解度的簡易測定方法[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2002，21（2）：113－115.

[6]李書國，陳輝，莊玉亭.復(fù)合酶法制備活性寡肽研究[J].食品與油脂，2001（3）：5－7.

[7]劉靜，陳均志.微波雙酶協(xié)同水解大豆分離蛋白制備小分子肽的研究[J].食品研究與開發(fā)，2006，27（8）：9－12.

[8]姜莉.核桃渣制備核桃蛋白和多肽的研究[D].陜西：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007.

Effect of microwave on enzymolysis of walnut protein

ZHANG Xing-can1，ZHAO Sheng-lan2，GE Feng1，LIU Di-qiu1，HAN Ben-yong1，CHEN Ling2，CHEN Chao-yin1，*
（1.Kunming University of Science and Technology，Kunming 650224，China；2.Yunnan College of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650200，China）

Papain and neutral protease were used to hydrolyze walnut protein under the condition of microwave heating and water-bath heating respectively，using degree of hydrolysis as standards，the optimized conditions of one enzymolysis were found.The results showed that microwave heating could improve efficiency of enzymolysis about tenfold to fortyfold，and neutral protease was better than papain.

microwave；walnut protein；degree of hydrolysis

TS255.6

B

1002-0306（2012）03-0252-03

2011－03－15 *通訊聯(lián)系人

張興燦（1987-），男，在讀碩士，研究方向：生物技術(shù)制藥。

云南省科技計劃項目（2009EB081）。