李峰 可春梅 付津平 王彥淇 陳裕

近年來，肺結(jié)核患者的發(fā)病率仍呈逐步上升趨勢(shì)，其中痰涂片陰性（涂陰）肺結(jié)核患者占肺結(jié)核總數(shù)的40%～60%［1］。因此，早期、有效的結(jié)核病診斷，尤其是對(duì)涂陰肺結(jié)核病的診斷已成為人們關(guān)注的重點(diǎn)之一［2］。本研究對(duì)我院2009年8月至2011年5月住院的涂陰肺結(jié)核患者的支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行集菌涂片，并與BACTEC MGIT960快速培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)分枝桿菌的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，旨在探討支氣管肺泡灌洗液檢測(cè)技術(shù)對(duì)涂陰肺結(jié)核的診斷價(jià)值，茲報(bào)告如下。

材料和方法

1．患者來源：入選患者為2009年8月至2011年5月期間在我院住院的涂陰肺結(jié)核患者555例，其中男性379例，女性176例；年齡15～81歲，平均年齡（33±13）歲。所有患者均留取痰標(biāo)本3次以上，每次痰涂片抗酸染色結(jié)果均為陰性。結(jié)合臨床癥狀和胸部X線結(jié)果、PPD或血清抗體檢測(cè)等初步診斷為肺結(jié)核［3］。

2．材料：上述患者的支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本。采集方法如下：患者經(jīng)術(shù)前準(zhǔn)備后行鼻部局麻，之后經(jīng)纖維支氣管鏡引入支氣管肺泡灌洗管至黏膜表現(xiàn)異常的支氣管或X線胸片提示肺部病變所屬支氣管，并超越支氣管鏡約2～3 c m，注入1．5 ml氣體使支氣管肺泡灌洗管末端的球囊充氣，嵌頓于支氣管管腔內(nèi)，經(jīng)灌洗管注入10～20 ml無菌生理鹽水，通過此管負(fù)壓吸引（壓力為25～100 mm Hg；1 mm Hg＝0．133 k Pa）將標(biāo)本收集至無菌瓶內(nèi)即可，2 h內(nèi)送檢。

3．儀器和培養(yǎng)基：美國BD公司生產(chǎn)的BACTEC MGIT960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)、MGIT培養(yǎng)管（批號(hào)：9115036、9234537、0344881）及其相應(yīng)配套試劑。

4．痰檢室質(zhì)量控制：（1）抗酸染色液：由鄭州方欣生物科技有限責(zé)任公司提供。（2）室內(nèi)質(zhì)控：每日抽查痰涂片總數(shù)的10%，由負(fù)責(zé)人審核抽查涂片與當(dāng)日的所報(bào)結(jié)果是否符合。2009年1月至2011年5月未有失控記錄。每月統(tǒng)計(jì)Mtb培養(yǎng)污染率（污染率＝當(dāng)月培養(yǎng)污染例數(shù)／當(dāng)月所做培養(yǎng)總例數(shù)×100%）均＜5%。

5．方法：（1）標(biāo)本處理：將采集的患者支氣管肺泡灌洗液6～8 ml，平均分裝在A、B管中，3000×g離心30 min備用。（2）集菌涂片：將A管棄去上清液，取沉渣涂片，經(jīng)抗酸染色后鏡檢，具體操作方法參見文獻(xiàn)［4］。（3）培養(yǎng)法：①將B管棄去上清液，余1 ml與4%Na OH以1∶2的比例加入羅氏離心管中混合，經(jīng)旋渦混合器震蕩30 s，室溫靜置15 min。②加入無菌生理鹽水至羅氏離心管50 ml刻度處，旋緊管蓋，3000×g離心20 min后棄上清，加入1 ml無菌生理鹽水混勻。③取0．5 ml接種至已加有0．8 ml抑菌劑的MGIT培養(yǎng)管。（以上步驟均在生物安全柜中進(jìn)行）。④將MGIT培養(yǎng)管掃描后放入BACTEC MGIT960系統(tǒng)孵育抽屜中培養(yǎng)，由儀器自動(dòng)監(jiān)測(cè)。（4）結(jié)果報(bào)告：集菌涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌報(bào)告抗酸桿菌集菌陽性。BACTEC MGIT960快速培養(yǎng)系統(tǒng)報(bào)告陽性后取菌液涂片，經(jīng)抗酸染色證實(shí)為抗酸桿菌，報(bào)告分枝桿菌培養(yǎng)陽性；超過42 d儀器報(bào)陰性、肉眼觀察未長菌，報(bào)告分枝桿菌培養(yǎng)陰性；污染標(biāo)本建議患者復(fù)查。（5）菌型鑒定：將兩種方法陽性標(biāo)本菌落均分別轉(zhuǎn)種至對(duì)硝基苯甲酸（PNB）培養(yǎng)基與2-羧酸肼噻吩（TCH）培養(yǎng)基以鑒定菌型。

6．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：對(duì)支氣管肺泡灌洗液集菌涂片、快速培養(yǎng)檢測(cè)分枝桿菌結(jié)果進(jìn)行比較，采用配對(duì)資料卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

555份支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本經(jīng)BACTEC MGIT960快速培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)，有4份出現(xiàn)污染，污染率0．72%，在實(shí)驗(yàn)室允許污染率范圍內(nèi)。555份支氣管肺泡灌洗液集菌涂片和BACTEC MGIT960快速培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)陽性檢出結(jié)果分別為：集菌涂片37例（6．67%），BACTEC MGIT960快速培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)118例（21．42%）（表1）。兩種方法陽性檢出結(jié)果之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝72．09，P＜0．005），見表2。兩種方法聯(lián)合檢測(cè)，共檢出分枝桿菌陽性標(biāo)本123例，陽性率為22．16%。經(jīng)過菌型鑒定，此123例陽性標(biāo)本菌落均為人結(jié)核分枝桿菌。

表1 支氣管肺泡灌洗液兩種方法檢測(cè)結(jié)果

表2 集菌涂片與快速培養(yǎng)兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較（例）

討 論

據(jù)報(bào)道，肺結(jié)核患者中，2／3以上為菌陰型［5］，臨床上往往依靠體征及影像學(xué)手段來診斷，易造成誤診漏診，不利于結(jié)核病疫情控制。常規(guī)痰涂片抗酸桿菌陰性的肺結(jié)核患者并非全部為不排菌，其影響因素較多；如患者留取標(biāo)本的合格性，病變嚴(yán)重程度，排菌量的多少，以及檢測(cè)方法的局限性等，導(dǎo)致部分排菌患者診斷為菌陰型。國內(nèi)外許多研究認(rèn)為，菌陰肺結(jié)核接觸者被感染幾率為7．3%～21．0%［6］。因此，如何提高 Mtb的檢出率，早期發(fā)現(xiàn)傳染源，有其重要價(jià)值。

支氣管肺泡灌洗液是通過纖維支氣管鏡（簡稱“纖支鏡”）向支氣管肺泡注入生理鹽水，對(duì)病變肺段進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，通過負(fù)壓吸引采集灌洗液。獲得的標(biāo)本是從呼吸道深部病灶處收集，收集量大，經(jīng)集菌處理后作涂片或培養(yǎng)，可以提高M(jìn)tb的檢出率。文獻(xiàn)報(bào)道，支氣管灌洗液集菌涂片和培養(yǎng)陽性率分別為6．4%～38．3%、12．2%～87．3%［7-10］。雖然結(jié)果差距較大，但論證后均肯定支氣管肺泡灌洗液對(duì)菌陰肺結(jié)核有診斷價(jià)值。

本研究所采用的培養(yǎng)方法為BACTEC MGIT960分枝桿菌培養(yǎng)儀快速培養(yǎng)，該方法具有較高的靈敏度和特異度，與傳統(tǒng)改良羅氏培養(yǎng)法相比，BACTEC MGIT960快速培養(yǎng)的優(yōu)越性更加突出［11］。這主要因?yàn)锽ACTEC MGIT960培養(yǎng)基營養(yǎng)成分豐富，并有特殊的雜菌抑制劑。同時(shí)，BACTEC MGIT960培養(yǎng)基是液體，擴(kuò)大了細(xì)菌與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面，能促進(jìn)分枝桿菌快速生長。另外，此系統(tǒng)具有靈敏特異的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，當(dāng)培養(yǎng)出分枝桿菌時(shí)可及時(shí)判定，大大縮短陽性檢出時(shí)間，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。本研究對(duì)555例痰菌涂片陰性肺結(jié)核患者的支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行集菌涂片和BACTEC MGIT960快速培養(yǎng)，陽性檢出率分別為6．67%與21．42%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩種檢測(cè)方法陽性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示BACTEC MGIT960快速培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)分枝桿菌優(yōu)勢(shì)突出。兩種檢測(cè)方法的陽性率均在文獻(xiàn)報(bào)道［6-9］范圍之內(nèi)，但是接近下限水平，可能與對(duì)象選擇、患者狀態(tài)、灌洗液量、檢測(cè)方法的選擇有關(guān)。兩種方法聯(lián)合檢測(cè)，陽性檢出率為22．16%，高于單獨(dú)做集菌涂片或單獨(dú)做BACTEC MGIT960快速培養(yǎng)。

綜上所述，支氣管肺泡灌洗液診斷痰菌涂陰肺結(jié)核與目前先進(jìn)的細(xì)菌學(xué)技術(shù)多項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，可有效提高M(jìn)tb檢出率。對(duì)早期發(fā)現(xiàn)傳染源，及時(shí)為臨床提供準(zhǔn)確的診斷和治療依據(jù)，控制結(jié)核病疫情具有重要意義。

［1］肖和平．菌陰肺結(jié)核在結(jié)核病控制中的重要性．中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28（10）：665-666．

［2］歐喜超，趙雁林．結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷及存在的難題．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，34（2）：97-99．

［3］中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)．肺結(jié)核診斷和治療指南．中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24（2）：70-74．

［4］中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司．全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程．3版．南京：東南大學(xué)出版社，2006．

［5］全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室．2000年全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告．中國防癆雜志，2002，24（2）：65-108．

［6］顧紅艷，戴建忠，施軍衛(wèi)，等．支氣管肺泡灌洗液多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)不典型肺結(jié)核的診斷價(jià)值探討．臨床肺科雜志，2008，13（9）：1149-1150．

［7］普興福，李梅春．支氣管肺泡灌洗液檢測(cè)分枝桿菌在診斷肺結(jié)核中的應(yīng)用．中國防癆雜志，2009，31（11）：679．

［8］陳東寧，馮俐．支氣管鏡多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)菌陰肺結(jié)核的診斷價(jià)值探討．中國內(nèi)鏡雜志，2007，13（6）：590-592，595．

［9］肖海浩，湯春梅，張言斌，等．支氣管鏡及相關(guān)檢測(cè)對(duì)菌陰肺結(jié)核的診斷價(jià)值．醫(yī)學(xué)綜述，2009，15（24）：3817-3820．

［10］彭勛，常占平，汪曉琴，等．纖支鏡灌洗液的結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)對(duì)不典型肺結(jié)核的診斷價(jià)值．中國防癆雜志，2003，25（3）：143-145．

［11］袁淑平，侯宏偉，李欣，等．支氣管肺泡灌洗液BACTEC MGIT960 system快速分離結(jié)核桿菌的效果評(píng)價(jià)．河北醫(yī)藥，2008，30（9）：1384-1385．