石 堅(jiān)，郭亞東，匡栩源，蘭玲梅，蔡繼峰，2，王紅杰

（1.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，湖南 長沙 410013；2.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200063；3.中山市公安局小欖分局，廣東 中山 528415）

應(yīng)用16S rDNA短序列片段鑒定常見嗜尸性麗蠅

石 堅(jiān)1，郭亞東1，匡栩源1，蘭玲梅1，蔡繼峰1，2，王紅杰3

（1.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，湖南 長沙 410013；2.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200063；3.中山市公安局小欖分局，廣東 中山 528415）

目的 利用16S rDNA中289bp序列對常見嗜尸性麗蠅進(jìn)行種類鑒定。 方法 從14個(gè)省市戶外采集麗蠅科3屬6種共計(jì)26個(gè)蠅類樣本。利用CTAB法提取蠅類胸肌DNA，對16S rDNA的289bp基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，測序并上傳至GenBank，按鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過序列分析建立種內(nèi)及種間進(jìn)化分歧表。 結(jié)果 上述蠅類按照不同屬、種分別聚類，其種內(nèi)進(jìn)化分歧均數(shù)均為0，種間進(jìn)化分歧均數(shù)在0.3%～6.5%。 結(jié)論 16S rDNA上289bp基因序列能有效地對國內(nèi)常見麗蠅進(jìn)行種類鑒定，應(yīng)用該片段具有快速、低耗等優(yōu)點(diǎn)，為應(yīng)用嗜尸性麗蠅推斷死亡時(shí)間提供可能。

法醫(yī)遺傳學(xué)；昆蟲學(xué)；DNA，核糖體；嗜尸性昆蟲；麗蠅科

法醫(yī)昆蟲學(xué)的主要任務(wù)是對各類嗜尸性昆蟲進(jìn)行迅速、準(zhǔn)確的種類鑒定，進(jìn)而對死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）和死亡地點(diǎn)進(jìn)行推斷[1-2]。尸體上最早發(fā)現(xiàn)的往往是雙翅目（Diptera）麗蠅科的蠅類，因而其在死亡時(shí)間推斷中的作用極其重要[3]。但是，通過形態(tài)學(xué)來鑒定麗蠅種類的難度較大，尤其是麗蠅幼蟲形態(tài)學(xué)上的差距較小，不易鑒別[4]。分子鑒定方法作為形態(tài)學(xué)鑒定方法的補(bǔ)充手段，被越來越多的法醫(yī)昆蟲學(xué)研究者所接受，近年來國內(nèi)外出現(xiàn)了大量嗜尸性蠅類分子鑒定的研究報(bào)道[4-7]。上述研究多采用COⅠ和COⅡ全序列進(jìn)行種類鑒定，該序列全長約2.3 kb，具有較高的鑒別效力。然而全序列不利于嗜尸性昆蟲分子標(biāo)記的推廣和應(yīng)用，尤其不適合基層法醫(yī)工作者[8-9]。線粒體DNA（mtDNA）的16S rDNA已被證實(shí)可以用來進(jìn)行麻蠅科[9]、家蠅科[10]及部分麗蠅科[11]的種類鑒定。本研究對嗜尸性麗蠅mtDNA 16S rDNA中289bp序列片段進(jìn)行分析，對我國14個(gè)省市常見的6種嗜尸性麗蠅進(jìn)行種類鑒定。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）（美國Amresco公司），2×GoTaq?Green Master Mix PCR試劑盒（美國Promega公司），蛋白核酸測定儀（美國Eppendorf公司），9600型PCR擴(kuò)增儀（美國PE公司），Tanon EPS-300電泳儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 樣本

隨機(jī)采集蘭州、銀川、天津、臨沂、北京、新鄉(xiāng)、蕪湖、長沙、湘陰、大同、石家莊、南寧、福州、包頭、?？?4個(gè)省市15個(gè)地區(qū)放置于室外草地家兔尸體上的6只絲光綠蠅Lucilia sericata（Meigen）、6只叉葉綠蠅Lucilia caesar（Greenbottle）、1只反吐麗蠅Calliphora vomitoria（Linnaeus）、2只巨尾阿麗蠅Aldrichina grahami（Aldrich）、9只大頭金蠅Chrysomya megacephala（Fabricius）、2只緋顏裸金蠅Achoetandrus rufifacies（Macquart），共26只。此外，采用麻蠅科（Sarcophagidae）的2只棕尾別麻蠅Sarcophaga peregrina（Robineau-Desvoidy）作為外群。上述樣本用75%的乙醇?xì)⑺?，室溫風(fēng)干保存。

1.3 mtDNA的提取

取樣本胸肌，清洗、搗碎，用CTAB法[12]提取胸肌mtDNA，并溶解于TE緩沖液中，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增

引物采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，引物序列為：正向引物5′-CGCTGTTATCCCTAAGGTAA-3′，反向引物5′-CTGGTATGAAAGGTTTGACG-3′。采用Green Master Mix PCR試劑盒對16S rDNA中289 bp的目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系總體積為25 μL，其中含有40 ng DNA模板，6 μL dNTP（1 mmol/mL），1.0 U Taq聚合酶，2.5μL緩沖液（其中Mg2+1.5mmol/L），雙向引物各2.5 μL（10 μmol/L），加去離子水至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，50.8℃ 30 s，72℃ 30s，38個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。

1.5 測序與進(jìn)化分析

PCR產(chǎn)物由華大基因武漢分公司測序，測序結(jié)果上傳至GenBank，然后用MEGA 4.0軟件包進(jìn)行結(jié)果分析，對上述所得不同地區(qū)各種蠅類的數(shù)據(jù)按鄰接法（neighbor-joining）[13]構(gòu)建不同地區(qū)蠅類種內(nèi)和種間的系統(tǒng)發(fā)育樹，探討地區(qū)差異性及種內(nèi)和種間的遺傳關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)分類鑒定結(jié)果

上述26只蠅類經(jīng)形態(tài)學(xué)分類鑒定，均屬麗蠅科，分為3屬6種。綠蠅屬：絲光綠蠅、叉葉綠蠅；金蠅屬：大頭金蠅、緋顏裸金蠅；麗蠅屬：反吐麗蠅、巨尾阿麗蠅。

2.2 基因序列比對分析

將所測得的上述26只蠅類樣本mtDNA上16S rDNA中的289 bp基因序列在GenBank中作BLAST搜索，利用核酸序列分析軟件MEGA 4.0對序列進(jìn)行比對，并將完整的序列提交GenBank注冊（表1）。結(jié)果表明不同屬、種之間存在著比較明顯的序列差異。

表1 樣本種類、采集信息和16S rDNA部分基因序列GenBank登錄號

2.3 鄰接法建立系統(tǒng)發(fā)育樹

運(yùn)用MEGA 4.0軟件包對上述各種蠅類mtDNA上16S rDNA的289 bp基因序列進(jìn)行分析，用鄰接法（neighbor-joining）建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果按照不同屬、種分別聚類，能夠達(dá)到鑒別蠅類種類的目的（圖1）。

圖1 基于樣本蠅類mtDNA 16S rDNA中289bp基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 種內(nèi)及種間進(jìn)化分歧

運(yùn)用MEGA 4.0軟件包對各蠅類mtDNA上16S rDNA的289bp基因序列進(jìn)行分析后，建立種內(nèi)及種間進(jìn)化分歧表。

種內(nèi)分歧：上述6只絲光綠蠅、6只叉葉綠蠅、2只巨尾阿麗蠅、9只大頭金蠅、2只緋顏裸金蠅和1只反吐麗蠅mtDNA上16S rDNA的289bp基因序列的種內(nèi)進(jìn)化分歧均數(shù)均為0（表2）。種間分歧：上述6種蠅類的種間進(jìn)化分歧均數(shù)在0.3%～6.5%（表3）。

一般認(rèn)為，種內(nèi)進(jìn)化歧數(shù)應(yīng)小于3%，種間進(jìn)化歧數(shù)應(yīng)大于3%，最好大于5%，但要結(jié)合片段的長度和位置進(jìn)行分析。

26 ~，1 8歧分化進(jìn)間種及內(nèi)種列序因基289bp中A NrD16S上A N tD m蠅麗性尸嗜只262表25242322212019181716151413121110987654321號序0.000 12 0.0000.0003 0.0000.0000.0004 0.0000.0000.0000.0005 0.0000.0000.0000.0000.0006 0.0210.0210.0210.0210.0210.0217 0.0000.0210.0210.0210.0210.0210.0218 0.0000.0000.0210.0210.0210.0210.0210.0219 0.0000.0000.0000.0210.0210.0210.0210.0210.02110 0.0000.0000.0000.0000.0210.0210.0210.0210.0210.02111 0.0000.0000.0000.0000.0000.0210.0210.0210.0210.0210.02112 0.0390.0390.0390.0390.0390.0390.0430.0430.0430.0430.0430.04313 0.0030.0390.0390.0390.0390.0390.0390.0430.0430.0430.0430.0430.04314 0.0000.0030.0390.0390.0390.0390.0390.0390.0430.0430.0430.0430.0430.04315 0.0500.0500.0500.0580.0580.0580.0580.0580.0580.0650.0650.0650.0650.0650.06516 0.0000.0500.0500.0500.0580.0580.0580.0580.0580.0580.0650.0650.0650.0650.0650.06517 0.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03918 0.0000.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03919 0.0000.0000.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03920 0.0000.0000.0000.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03921 0.0000.0000.0000.0000.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03922 0.0000.0000.0000.0000.0000.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03923 0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03924 0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03925 0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03926蠅金裸顏緋為17，16~蠅麗阿尾巨為5，14~1蠅麗吐反為 ，13蠅綠葉叉為 ，7~12蠅綠光絲為 ；1~6類種分區(qū)夠能，大較數(shù)均歧分化進(jìn)間種，小較數(shù)均歧分化進(jìn)內(nèi)種的類蠅性蠅尸金嗜頭述大上：為注26

表3 6種嗜尸性麗蠅mtDNA 16S rDNA中289bp基因序列種間進(jìn)化分歧

3 討 論

近年來，利用嗜尸性麻蠅進(jìn)行死亡時(shí)間推斷的報(bào)道較多[14-15]，而利用嗜尸性麗蠅進(jìn)行死亡時(shí)間推斷的報(bào)道較少，主要原因在于繁多的嗜尸性麗蠅種類使得形態(tài)學(xué)鑒別要點(diǎn)極為復(fù)雜，不易被廣大法醫(yī)工作者所掌握，此外為了得到相對容易鑒別的成蟲，往往需要把收集的幼蟲或蛹帶回實(shí)驗(yàn)室，培養(yǎng)至成蟲階段再進(jìn)行種類鑒定，這一步驟會消耗大量時(shí)間，給案件的迅速偵破帶來不利影響，同時(shí)還有孵化失敗的風(fēng)險(xiǎn)。

1994年Sperling等[5]首次將基于DNA的方法用于嗜尸性昆蟲種類鑒定，在此后的十多年中，DNA分子鑒定方法作為形態(tài)學(xué)鑒定方法的補(bǔ)充手段，被越來越多的法醫(yī)昆蟲學(xué)研究者所接受。雖然COⅠ+COⅡ全序列分析是獲取信息量最全的方法，也是較精確的分析方法，但全序列無疑會耗費(fèi)較多的經(jīng)費(fèi)和時(shí)間，因此有必要對短片段鑒定進(jìn)行研究。目前文獻(xiàn)報(bào)道的最短片段約為200bp[8]，這類短序列擴(kuò)增比較容易，對樣本保存條件要求也比較寬松，不足之處是這類片段所包含的信息量過少。

本研究通過MEGA 4.0軟件包運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)上的距離法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，推斷其親緣關(guān)系及遺傳距離，進(jìn)而達(dá)到對嗜尸性麗蠅進(jìn)行種類鑒定的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在屬的水平，麗蠅科的綠蠅屬和金蠅屬、麗蠅屬區(qū)分較好。不同蠅類的種間差異明顯（表3），說明運(yùn)用該方法可有效地對嗜尸性蠅類鑒定到種的水平。應(yīng)用16S rRNA中289bp基因序列的分子鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類鑒定結(jié)果一致，說明通過檢測嗜尸性蠅類mtDNA上16S rDNA中289bp基因序列來進(jìn)行種屬鑒別的方法是可行的。本實(shí)驗(yàn)中所運(yùn)用的方法，可以直接獲得嚴(yán)格準(zhǔn)確的序列信息，對檢測人員專業(yè)水平及實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求不高，一般的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室均能做到，理論依據(jù)以及研究思路也相對簡潔清晰，容易在實(shí)際工作中推廣應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)中觀察到雖然種間差異明顯，可以達(dá)到種類鑒定的目的，但巨尾阿麗蠅和大頭金蠅的種間差異較?。ū?），兩種并非近緣種，形態(tài)學(xué)差異也十分明顯，這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)所選取的289 bp基因序列片段小，所含的信息量相對較少所造成的，也可能是樣本量過小，需要補(bǔ)充數(shù)據(jù)后進(jìn)一步研究。

分子鑒定作為形態(tài)學(xué)鑒定的輔助手段具有較高的實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值，小片段分子標(biāo)記具有高效、快速、經(jīng)濟(jì)、簡單等優(yōu)點(diǎn)，利于在我國基層進(jìn)行推廣應(yīng)用，但小片段分子標(biāo)記存在著一定的缺陷和不足，仍需要更為深入的研究和探索。

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2011-04-01）

（本文編輯：李成濤）

Identification of Sarcosaphagous Calliphorid Flies by Analyzing the Sequence of 16S rDNA

SHI Jian1,GUO Ya-dong1,KUANG Xu-yuan1,LAN Ling-mei1,CAI Ji-feng1,2,WANG Hong-jie3
（1.Department of Forensic Medicine,School of Basic Medical Science,Central South University,Changsha 410013,China;2.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,P.R.China,Shanghai 200063,China;3.Xiaolan Branch of Zhongshan Public Security Bureau,Zhongshan 528415,China）

Objective To explore the application of a 289 bp fragment of the 16S rDNA gene to identify various species of sarcosaphagous Calliphorid flies.Methods Twenty-six Calliphorid flies were collected from 14 Chinese provinces.All specimens were properly assigned into three genera and six species.The DNA of the pectoralis was extracted using CTAB method.Then PCR amplification was done for the 289bp fragment of the 16S rDNA gene.The PCR products were then purified and sequenced,and the obtained sequences were uploaded to GenBank.The phylogenetic tree was built by the neighbor-joining method and intraspecific and interspecific divergences were calculated by sequence analysis.Results The above 26 sarcosaphagous flies could be well clustered according to different genera and species.The evolutional intraspecific values were all zero,the evolutional interspecific variations varied from 0.3%to 6.5%.Conclusion The 289 bp fragment of the 16S rDNA of sarcosaphagous flies can be effectively used to identify most of the flies at species level.This method appears to be fast and low dissipative,which might be used to estimate postmortem interval by sarcosaphagous flies.

forensic genetics;entomology;DNA,ribosomal;sarcosaphagous insects;Calliphoridae

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.04.010

1004-5619（2012）04-0281-06

湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（11JJ5075）；上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（KF1203）

石堅(jiān)（1988—），男，陜西西安人，2008級臨床醫(yī)學(xué)學(xué)生；E-mail：shijian88116@163.com

蔡繼峰，男，教授，主要從事法醫(yī)昆蟲學(xué)研究；E-mail：cjf_jifeng@163.com