張香桂，倪萬潮，沈新蓮，徐 鵬

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，江蘇 南京210014）

棉花是常異花授粉作物，利用雜種優(yōu)勢是提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)的重要途徑。中國是世界產(chǎn)棉國中種植雜交棉最多的國家之一，近年來我國轉(zhuǎn)基因抗蟲雜交棉花在生產(chǎn)上快速發(fā)展，尤以育苗移栽的長江流域棉區(qū)發(fā)展迅速。目前，江蘇省80%以上的棉田種植雜交棉，其中多為轉(zhuǎn)基因抗蟲雜交棉，其雜交種子主要采用人工制種技術(shù)生產(chǎn)。隨著勞動力成本的迅速提高，較高的種子生產(chǎn)成本已成為我國進一步發(fā)展轉(zhuǎn)基因抗蟲雜交棉的“瓶頸”，而其中用工最多的環(huán)節(jié)則是人工去雄。若不去雄直接授粉，棉花雜交種子的成本將顯著降低。利用棉花高柱頭材料或人為誘導(dǎo)棉花高柱頭，用于棉花雜交制種則可以實現(xiàn)不去雄直接授粉[1，2]，但雜交種子純度往往難以保證。能否采用提前授粉法解決雜交種子的純度問題？所謂提前授粉，就是在棉花自花散粉前已完成授粉甚至受精過程，在生產(chǎn)上就是在開花前的一天或當日早上花苞尚未開放散粉前的時段。而此時段授粉棉花柱頭是否有活性，花粉如何收集與保存，制種效率如何？對棉花花粉貯藏和當日花、隔日花（開花后第2天的花）柱頭活力強弱的變化已有報道[3～5]，而對棉花次日花（第2天開放的花）柱頭是否已成熟，能否接受正常的花粉而結(jié)實，則少見報道。同時，在對棉花花粉活性和柱頭活性測定方法上的研究上，對花粉活力的測定方法報道較多，常用的有聯(lián)苯胺-甲耐酚染色法、FDA熒光染色法、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)芽法、花柱基部花粉管穿透計數(shù)法和醋酸洋紅反應(yīng)法等，而對棉花柱頭活性的測定多采用田間分時段授粉法[3～5]，費工費時，受花粉活性和外界環(huán)境因素影響大。本文借鑒其他作物柱頭可授性檢測方法，即用聯(lián)苯胺—過氧化氫法測定棉花柱頭的可授性，同時在田間進行授粉驗證，以期探索棉花柱頭活性快速測定方法，為棉花雜交育種和探索新的棉花高效制種技術(shù)提供參考。現(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下：

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 棉花品種：試驗選用陸地棉常規(guī)高產(chǎn)品種（1）蘇棉 9 號、（2）蘇棉 19 號；抗蟲棉品種（1）33B、（2）中植棉 3 號；彩色棉（1）棕絮品系 CP3、（2）綠絮品系 CP4；高品質(zhì)棉品系（1）1176、（2）1196。

1.1.2 試驗地點：試驗于2010年在江蘇省溧水植物科學(xué)基地進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 棉花柱頭活性測定方法：采用聯(lián)苯胺—過氧化氫法。聯(lián)苯胺—過氧化氫反應(yīng)液為1%聯(lián)苯胺溶液、3%過氧化氫溶液、水的體積比為4:11:22的混合液，裝入棕色瓶內(nèi)，放在4℃冰箱保存?zhèn)溆?。試劑配制?%聯(lián)苯胺溶液：稱1 g聯(lián)苯胺固體溶于100 mL50%的酒精，裝入棕色瓶內(nèi)備用；3%過氧化氫溶液：取10 mL30%的過氧化氫和90 mL蒸餾水混合，裝入棕色瓶內(nèi)備用；水：蒸餾水若干。

1.2.2 花粉活性測定方法：采用液體培養(yǎng)基花粉培養(yǎng)法，培養(yǎng)基配方由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)唐燦明教授提供，培養(yǎng)溫度26℃～28℃。培養(yǎng)方法：在載玻片上滴2滴培養(yǎng)液，取3個花藥放在培養(yǎng)液中,輕柔出花粉，將花藥踢出，加上蓋玻片，放在預(yù)先備好的放有少量加水衛(wèi)生紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3 h左右，在顯微鏡下即可觀察到花粉管的萌芽和伸長情況，順著一個方向記數(shù)，計算百分數(shù)。

2 結(jié)果與分析

用聯(lián)苯胺—過氧化氫法測定棉花柱頭活性，我們試用了三種操作方法，試驗結(jié)果如下：

2.1 第一種操作方法的步驟和測定結(jié)果

借用張志良等（2004）的方法，在上午10:00之前，取8個棉花品種的當日花、次日花柱頭各3個，分別放入凹面載玻片中 （即重復(fù)3次），用移液槍滴加聯(lián)苯胺—過氧化氫反應(yīng)液二三滴。觀察其反應(yīng)，均是切口處有氣泡產(chǎn)生，其他部位很少產(chǎn)生氣泡，柱頭顏色變化不明顯。此法不易區(qū)分棉花柱頭的活性。

2.2 第二種操作方法的步驟和測定結(jié)果

在上午10:00之前，取8個棉花品種的當日花、次日花柱頭各3個，將整個待測的柱頭切為3段放入凹面載玻片中，其他操作同上。觀察其反應(yīng)，待測柱頭均產(chǎn)生較多的氣泡，且傷口處均變藍色。此法不能區(qū)分棉花柱頭的活性。

2.3 第三種操作方法的步驟和測定結(jié)果

在上午10:00之前，取8個棉花品種的當日花、次日花柱頭，在離心管上標記，各3個重復(fù)。然后依次將柱頭取下，柱頭的頂端朝向離心管底部放入離心管內(nèi)，用移液槍加入聯(lián)苯胺—過氧化氫反應(yīng)液，直至反應(yīng)液淹沒全部柱頭，蓋上離心管的蓋子，觀察結(jié)果如表1。

表1 棉花柱頭活性測定結(jié)果

從表1測定的結(jié)果看，（1）不同品種的次日花柱頭顏色變化不明顯，氣泡產(chǎn)生也較少，彩色棉的柱頭幾乎看不到變色。說明不管是什么品種的次日花的柱頭活性都較差；（2）在當日花即當日完全開放花柱頭顏色變化中，抗蟲品種顏色變化快且染色深，高產(chǎn)棉和高品質(zhì)棉品種柱頭1 h后方可染上色，而彩色棉柱頭顏色變化不及其他品種明顯；而柱頭產(chǎn)生的氣泡（不是傷口處）不同品種完全開放花產(chǎn)生的都較多，而且能夠維持較長的時間。說明不管是什么品種的當日花的柱頭活性都較高。

2.4 田間授粉結(jié)果

在室內(nèi)測定柱頭活性的同時，田間分不同時段進行授粉，所使用的母本品種為蘇棉9號，父本品種為33B。次日花授粉的花粉為上午取粉，存放在自己設(shè)計的授粉器中放入冰箱保存，使用時取出田間授粉，同時取少量測定花粉活性。花粉活性測定采用 “液體培養(yǎng)基花粉培養(yǎng)法”，以免因花粉活性差而影響試驗結(jié)果。次日花授粉的，邊去雄邊授粉，授粉后套管隔離；當日花授粉的花朵，在前一天人工去雄，去雄后套管隔離，每處理授粉50朵花，授粉后套管隔離。調(diào)查成鈴和結(jié)籽情況，結(jié)果如表2。

由表2可以看出，人工去雄后早上6：10授粉，花粉貯藏20 h以上，測定所使用的花粉活性在50%以上，但成鈴率極低，僅為8%，是花粉活性不足還是柱頭可授性影響，有待進一步試驗。從15：40到19：00不同時段提前授粉，成鈴率在40%～56%，且隨著時間的推移成鈴率有逐漸提高的趨勢，但單鈴健籽數(shù)都很少，最高僅在10.00個/鈴。提前授粉單鈴健籽數(shù)少，與室內(nèi)棉花柱頭活性測定結(jié)果相一致，即柱頭尚未達生理成熟可能是其主要原因。

表2 田間授粉成鈴情況調(diào)查結(jié)果

3 討論

在棉花雜交育種和利用雜種優(yōu)勢大量生產(chǎn)棉花雜交種子的過程中，提高雜交成鈴率和單鈴健籽數(shù)具有重要的現(xiàn)實意義。棉花雜交結(jié)實率的高低決定于花粉的活性和柱頭的可授性。研究棉花花粉活性的保存方法和柱頭可授性的變化，可為提高制種工效及探索新的制種途徑提供技術(shù)參考。

（1）本研究采用聯(lián)苯胺一過氧化氫反應(yīng)液漫過柱頭法測定棉花柱頭的活性，表現(xiàn)為活性高的柱頭，整個柱頭變藍黑色且充滿氣泡，并能保持較長時間；無活性柱頭產(chǎn)生氣泡少且柱頭始終不變色。在觀察顏色變化時，要注意柱頭和剪下柱頭的傷口處的不同，傷口處變色并不能代表是柱頭變色，不能用來證明柱頭具有可授性。此法可較清晰地區(qū)分棉花柱頭的活性。

（2）采用聯(lián)苯胺一過氧化氫反應(yīng)液漫過柱頭法測定棉花當日花和次日花柱頭的活性，表現(xiàn)為當日花柱頭變色明顯，產(chǎn)生的氣泡多，田間授粉成鈴率高，單鈴健籽數(shù)多；次日花柱頭變色不明顯，產(chǎn)生的氣泡少甚至無氣泡產(chǎn)生，田間授粉成鈴率雖較高，但單鈴健籽數(shù)少。在花粉采用冷藏，授粉時測定花粉活力，基本排除花粉影響田間雜交結(jié)實因素的情況下，室內(nèi)測定與田間授粉結(jié)果相一致，說明采用聯(lián)苯胺一過氧化氫反應(yīng)液漫過柱頭法測定棉花柱頭活性的方法是可靠的。

（3）本試驗研究表明，棉花次日花柱頭活性尚未達完全的生理成熟，雖能接受正常花粉受精結(jié)實，但結(jié)實性差。利用棉花高柱頭材料或人工誘導(dǎo)棉花高柱頭材料進行雜交制種，為保證種子純度，若采用提前授粉，須探索活化棉花柱頭活性的方法。

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