朱淑惠，羅頌平，鄧煜燎

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)門(mén)診部，廣東 廣州510405;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科教研室，廣東 廣州510405)

卵巢是女性重要的生殖和內(nèi)分泌器官，隨著20 世紀(jì)90 年代卵巢冷凍保存技術(shù)和移植免疫學(xué)的發(fā)展，卵巢移植受到醫(yī)者越來(lái)越多的重視。影響移植成功的關(guān)鍵在于控制移植后的排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)移植卵巢的存活時(shí)間。近年來(lái)，隨著中藥免疫藥理研究的逐漸深入，中藥抗移植排斥作用的研究也取得了一定的進(jìn)展。壽胎丸出自《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，由菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、阿膠4 味中藥組成，具有補(bǔ)腎氣、固沖任、調(diào)氣血、安胎的作用。壽胎丸用于抗器官移植后免疫排斥反應(yīng)的思路主要源于對(duì)反復(fù)自然流產(chǎn)的治療。對(duì)于母體而言，胎兒相當(dāng)于同種半異體移植物，而自然流產(chǎn)可視為母體對(duì)胎兒的一種免疫排斥反應(yīng)。本課題建立SD 和Wistar 大鼠間同種異體卵巢移植模型，并建立Wistar 大鼠自體卵巢移植模型作對(duì)照，觀察補(bǔ)腎復(fù)方壽胎丸對(duì)同種大鼠自體及異體卵巢移植的影響，從移植模型體質(zhì)量及雌二醇(E2)的變化來(lái)探討補(bǔ)腎復(fù)方壽胎丸抗卵巢移植排斥反應(yīng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

Wistar 大鼠210 只，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為0047261，0048981，0049554，0050275，0050721，0050814。SD 大鼠120 只，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為0049729，0051023。大鼠均為雌性，SPF 級(jí)，10～12周齡，體質(zhì)量180～230 g，飼養(yǎng)于SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室，照明時(shí)間12 h/d(8:00—20:00)，相對(duì)濕度55% ±10%，溫度(22 ±2)℃，以消毒大鼠專(zhuān)用飼料和潔凈水飼養(yǎng)。

1.2 藥品、試劑與儀器

壽胎丸由菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、阿膠4 味中藥組成，均購(gòu)于康美藥業(yè)有限公司。每劑含生藥材200 g，按菟絲子∶桑寄生∶續(xù)斷∶阿膠=4 ∶3∶3∶1的比例，將菟絲子、桑寄生、續(xù)斷3 味藥加水750 mL，煎至150 mL，阿膠烊化，濃縮至100 mL，含生藥量2 g/mL。環(huán)孢A(CsA，新賽斯平軟膠囊)，25 mg/粒，杭州中美華東制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)090324，將之溶于適量蒸餾水中，定容為2 mg/mL 備用。E2免疫反應(yīng)試劑，購(gòu)自上海藍(lán)怡科技有限公司;1640 培養(yǎng)液、四季青新生牛血清、Sucrose、DMSO、100 mm 培養(yǎng)皿、水合氯醛、多聚甲醛、玻璃毛細(xì)管、苦味酸等，均購(gòu)自廣州威佳科技有限公司。AIA－1800 全自動(dòng)免疫分析儀，日本東曹株式會(huì)社產(chǎn)品;Kryo320－1.7 程序降溫儀，英國(guó)Planer 公司產(chǎn)品;高精度加液器及吸頭(2～20 μL、20～200 μL、200～1000 μL)、－20 ℃低溫冰箱、冷凍離心機(jī)、4 ℃冰箱、液氮及液氮罐、凍存管、玻璃試管、EP 管、記號(hào)筆、水浴箱、眼科手術(shù)器械等，均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)婦科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 動(dòng)物分組、模型的建立與給藥

取Wistar 大鼠210 只，隨機(jī)分為自體移植模型組、自體移植+壽胎丸組、異體移植模型組、異體移植+壽胎丸組、異體移植+環(huán)孢A(CsA)組、異體移植+ CsA + 壽胎丸組和正常對(duì)照組7 組，每組30 只。除正常對(duì)照組僅行腹部切開(kāi)縫合外，其余各組大鼠以100 g/L 水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，下腹部消毒，正中線切口，腹腔探查并摘除雙側(cè)卵巢，結(jié)扎殘端，術(shù)后傷口涂紅霉素軟膏抗感染。術(shù)后第5 天起，每天行細(xì)胞學(xué)涂片，連續(xù)9 d，涂片顯示無(wú)周期性變化，提示去勢(shì)徹底。

取出大鼠卵巢后，立即置于4 ℃含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，洗去血跡，用手術(shù)刀片將系膜去掉，冷凍保存。凍融方案采用Oktay 等1998 年提出的慢凍—快融經(jīng)典方案［1］。異體移植組:于偏離Wistar 大鼠原手術(shù)切口約0.5 cm 處縱行切開(kāi)1 cm，將SD 大鼠的雙側(cè)卵巢分別移植于Wistar 大鼠切口兩側(cè)的腹壁上，縫合皮膚，傷口涂紅霉素軟膏抗感染［2］。自體移植組:采用快融法復(fù)蘇冷凍卵巢［1］后，參照異體移植組手術(shù)方案移植。自體移植+壽胎丸組和異體移植 + 壽胎丸組均給予壽胎丸26.8 g/(kg·d)，28 d;異體移植+ CsA 組，給予CsA 10 μg/(g·d)，連用14 d 后，6 μg/(g·d)再連用14 d;異體移植+ CsA + 壽胎丸組，給予CsA 6 μg/(g·d)和壽胎丸26.8 g/(g·d)，連用28 d;自體移植模型組、異體移植模型組和正常對(duì)照組均給予等量生理鹽水28 d。各組均灌胃給藥。移植術(shù)后24 h 第1 次給藥，以后每隔24 h 給藥1 次。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 體質(zhì)量

移植術(shù)前1 日及移植術(shù)后第7，14，21，28，35 天時(shí)測(cè)量各組大鼠的體質(zhì)量并記錄。

1.4.2 動(dòng)情情況

通過(guò)陰道細(xì)胞涂片檢測(cè)。移植術(shù)前了解去勢(shì)后的Wistar 鼠的去勢(shì)情況。去勢(shì)術(shù)后第5 天起，每天行細(xì)胞學(xué)涂片檢查，連續(xù)9 d。若涂片顯示無(wú)周期性變化，提示去勢(shì)徹底。移植術(shù)后第5 天開(kāi)始行陰道細(xì)胞涂片，于10 ×10 倍光學(xué)顯微鏡下觀察，取5 個(gè)不同視野，計(jì)算白細(xì)胞、有核細(xì)胞、角化細(xì)胞各占百分?jǐn)?shù)。若滿(mǎn)視野均為角化細(xì)胞，則認(rèn)為動(dòng)物出現(xiàn)動(dòng)情周期。

1.4.3 血清E2水平

移植術(shù)前1 日，自眼眶后靜脈叢取血檢測(cè)去勢(shì)后的血清E2水平。移植術(shù)后第6～15 天、第16～25 天以及第26～35 天，根據(jù)陰道涂片，選動(dòng)情第1 天取血，以全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀自動(dòng)完成全部檢測(cè)步驟。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)()±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，兩組組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較根據(jù)設(shè)計(jì)不同分別采用單因素方差分析和析因設(shè)計(jì)的方差分析，多重比較用q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)體質(zhì)量對(duì)比

在移植后14 d，自體移植模型組大鼠體質(zhì)量與異體移植模型組、異體移植+壽胎丸組、正常對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);其余各組在各時(shí)點(diǎn)對(duì)比，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。自體移植壽胎丸組、異體移植模型組各有1 只大鼠因移植術(shù)前取血時(shí)麻醉過(guò)深致死，異體移植模型組另有1只大鼠因移植術(shù)后腸梗阻死亡，死亡大鼠未納入統(tǒng)計(jì)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)體質(zhì)量對(duì)比 g，±s

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)體質(zhì)量對(duì)比 g，±s

移植前1 d 移植前7 d 移植前移植前21 d 移植前28 d 移植前35 d分 組14 d動(dòng)物數(shù)動(dòng)物數(shù) 體質(zhì)量自體移植模型組 30 213.50±9.55 30 217.20±13.71 24 216.79±20.63 18 226.17±9.54 12 236.58±9.010 6 243.17±8.動(dòng)物數(shù) 體質(zhì)量動(dòng)物數(shù) 體質(zhì)量體質(zhì)量動(dòng)物數(shù) 體質(zhì)量動(dòng)物數(shù) 體質(zhì)量232自體移植壽胎丸組 29 211.20±11.70 29 219.47±14.78 24 223.88±15.19 18 227.94±13.53 12 245.17±11.595 6 245.17±12.624異體移植模型組 28 216.50±9.40 28 220.20±11.38 23 229.17±13.52* 18 231.78±13.06 12 242.33±15.899 6 247.00±14.227異體移植+壽胎丸組 30 213.43±9.79 30 217.87±10.76 24 229.83±12.40* 18 235.89±13.87 12 240.50±13.787 6 248.17±19.219異體移植+CsA 組 30 212.27±11.81 30 214.93±14.14 24 220.71±12.28 18 236.06±17.63 12 242.17±16.776 6 250.17±27.088異體移植+CsA+壽胎丸組 30 212.23±9.71 30 218.23±9.71 24 223.58±12.29 18 229.89±14.27 12 239.67±13.620 6 242.83±13.615正常對(duì)照組 30 209.17±10.48 30 220.57±9.67 24 228.63±9.97* 18 234.94±11.52 12 241.94±11.260 6 246.17±11.125

注:與自體移植模型組同期對(duì)比，*P＜0.05。

2.2 各組大鼠動(dòng)情情況對(duì)比

自體移植模型組30 只大鼠中動(dòng)情21 只，自體移植壽胎丸組29 只中動(dòng)情22 只，異體移植模型組28 只中動(dòng)情0 只;異體移植+壽胎丸組30 只中動(dòng)情5 只，異體移植+CsA 組30 只中動(dòng)情8 只，異體移植+CsA+壽胎丸組30 只中動(dòng)情10 只，正常對(duì)照組30 只中動(dòng)情30 只。

2.3 各組大鼠血清E2 水平對(duì)比

2.3.1 自體移植與異體移植模型大鼠不同時(shí)點(diǎn)E2水平對(duì)比

除移植前1d 這個(gè)時(shí)點(diǎn)外，其余3 個(gè)時(shí)點(diǎn)，異體移植模型組的E2水平均較自體移植模型組低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。自體移植模型組后2 個(gè)時(shí)點(diǎn)的E2水平、異體移植模型組后3 個(gè)時(shí)點(diǎn)的E2水平均較正常對(duì)照組低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示:異體卵巢移植后發(fā)生了嚴(yán)重的急性排斥反應(yīng)，自體卵巢移植過(guò)程中的凍融損傷、缺血缺氧損傷等因素也影響到移植卵巢的長(zhǎng)期存活。見(jiàn)表2。

表2 自體移植與異體移植模型大鼠不同時(shí)點(diǎn)E2 水平對(duì)比 pmol·L －1，±s

表2 自體移植與異體移植模型大鼠不同時(shí)點(diǎn)E2 水平對(duì)比 pmol·L －1，±s

注:與自體移植模型組同期對(duì)比，* P＜0.05;與正常對(duì)照組同期對(duì)比，# P＜0.05。

分 組1d動(dòng)物數(shù) E移植前2移植后第6～15天動(dòng)物數(shù) E 2移植后第16～25天動(dòng)物數(shù) E 2移植后第26～35天動(dòng)物數(shù) E 2自體移植模型組 30 46.52 ±22.11 30 76.81 ±23.18 18 70.14 ±20.27# 12 69.78 ±18.78#異體移植模型組 28 45.57 ±28.56 28 37.08 ±12.72* # 18 29.47 ±15.96* # 12 32.26 ±11.39* #正常對(duì)照組 30 58.18 ±13.27 30 88.27 ±27.52 18 101.40 ±23.81 12 108.05 ±36.80

2.3.2 自體卵巢移植兩組大鼠不同時(shí)點(diǎn)E2水平對(duì)比

兩組各時(shí)點(diǎn)的E2水平對(duì)比，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示壽胎丸在提高自體移植卵巢成活率、促進(jìn)內(nèi)分泌功能恢復(fù)等方面療效不明顯。見(jiàn)表3。

表3 自體移植模型組與自體移植+壽胎丸組大鼠不同時(shí)點(diǎn)E2 水平對(duì)比 pmol·L －1，±s

表3 自體移植模型組與自體移植+壽胎丸組大鼠不同時(shí)點(diǎn)E2 水平對(duì)比 pmol·L －1，±s

分 組1d動(dòng)物數(shù) E移植前2移植后第6～15天動(dòng)物數(shù) E 2移植后第16～25天動(dòng)物數(shù) E 2移植后第26～35天動(dòng)物數(shù) E 2自體移植模型組 30 46.52 ±22.11 30 76.81 ±23.18 18 70.14 ±20.27 12 69.78 ±18.78自體移植+壽胎丸組 29 40.65 ±16.98 29 70.19 ±22.01 18 79.04 ±22.34 12 76.69 ±37.42

2.3.3 異體卵巢移植各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)E2水平對(duì)比

對(duì)異體卵巢移植各組做單因素方差分析，移植前1 d，各組的E2水平對(duì)比，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);移植后第6～15 天、第16～25 天、第26～35 天，異體移植+CsA 組、異體移植+CsA +壽胎丸組的E2水平高于異體移植模型組和異體移植+壽胎丸組(P＜0.05);移植后第6～15 天、第26～35天，異體移植+CsA+壽胎丸組的E2水平高于異體移植+CsA 組(P＜0.05);異體移植+壽胎丸組的E2水平和異體移植模型組對(duì)比，在移植后各時(shí)點(diǎn)差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。經(jīng)析因設(shè)計(jì)的方差分析，在移植后第6～15 天、第16～25 天，CsA 的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示:CsA 可提高大鼠異體卵巢移植后的E2水平，壽胎丸與CsA 的交互作用是正向的。移植后第26～35 天，CsA 與壽胎丸的主效應(yīng)差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示:CsA 和壽胎丸均有抗移植排斥的作用，但單用壽胎丸，尚不能逆轉(zhuǎn)排斥。見(jiàn)表4。

表4 異體卵巢移植各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)E2 水平對(duì)比 pmol·L －1，±s

表4 異體卵巢移植各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)E2 水平對(duì)比 pmol·L －1，±s

分 組1d動(dòng)物數(shù) E移植前2移植后第6～15 天#△動(dòng)物數(shù) E 2移植后第16～25 天#動(dòng)物數(shù) E 2移植后第26～35 天*#動(dòng)物數(shù) E 2異體移植模型組 28 45.57 ±28.56 28 37.08 ±12.72 18 29.47 ±15.96 12 32.26 ±11.39異體移植+壽胎丸組 30 44.84 ±20.75 30 25.99 ±14.81 18 31.20 ±10.20 12 40.86 ±18.52異體移植+CsA 組 30 47.47 ±15.75 30 67.89 ±28.44※◆ 18 80.35 ±25.95※◆ 12 72.73 ±23.08※◆異體移植+CsA+壽胎丸組 30 50.35 ±10.02 30 88.63 ±33.00※◆☆ 18 90.86 ±32.75※◆ 12 97.07 ±35.45※◆☆

3 討 論

3.1 壽胎丸的現(xiàn)代藥理研究

壽胎丸為補(bǔ)腎安胎之代表方。方中重用菟絲子為主藥，菟絲子性柔潤(rùn)而多液，可平補(bǔ)腎陰腎陽(yáng)。該藥補(bǔ)而不燥，滋而不膩，為安胎之首選藥物?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》列其為上品，主治“續(xù)絕傷，補(bǔ)不足，益氣力，肥健人”。續(xù)斷補(bǔ)肝腎安胎，據(jù)藥理學(xué)研究，其有抗維生素E 缺乏癥的作用而利于孕卵發(fā)育。桑寄生補(bǔ)肝腎，兼養(yǎng)血安胎。阿膠能補(bǔ)血滋陰止血安胎。全方具有補(bǔ)腎氣、固沖任、調(diào)氣血、安胎的作用。臨床用于治療先兆流產(chǎn)、反復(fù)自然流產(chǎn)療效確切、顯著［3－6］。有研究證明，壽胎丸能促進(jìn)小鼠幼鼠的子宮和卵巢發(fā)育，對(duì)正常和妊娠大鼠離體子宮平滑肌的收縮頻率和活動(dòng)力有明顯抑制作用［7］。加味壽胎丸復(fù)方能提高妊娠期血清孕激素水平和子宮蛻膜孕激素受體(PR)的表達(dá)，改善患者外周血淋巴細(xì)胞亞群失衡，調(diào)節(jié)免疫功能，降低流產(chǎn)率［8］。

3.2 壽胎丸對(duì)自體卵巢移植大鼠E2 分泌的影響

移植術(shù)后E2的分泌變化說(shuō)明將自體卵巢移植到大鼠腹膜后，短時(shí)間內(nèi)即可重建血液循環(huán)，移植的卵巢也能恢復(fù)內(nèi)分泌功能。有研究［9］發(fā)現(xiàn):皮下無(wú)血管移植，移植物血管重建在移植后的48 h 就開(kāi)始了。本課題研究發(fā)現(xiàn):自體卵巢移植后第16～25 天、第26～35 天的E2分泌未繼續(xù)增多，僅維持在一個(gè)較高水平，較正常對(duì)照組低(P＜0.05)，提示移植卵巢過(guò)程中的凍融損傷、缺血缺氧損傷等因素，導(dǎo)致了大部分卵泡丟失，內(nèi)分泌功能相應(yīng)減退。有文獻(xiàn)［10］報(bào)道:卵巢組織在凍融過(guò)程中會(huì)損失7%的卵泡，但移植后組織的局部缺血性損傷會(huì)使移植物損失全部的生長(zhǎng)卵泡群，以及顯著數(shù)量的原始卵泡，新血供重新建立前可能喪失60%以上的原始卵泡，認(rèn)為卵巢移植后缺血損傷可能限制了自體移植卵巢長(zhǎng)期存活。

自體卵巢移植后缺血缺氧損傷是導(dǎo)致卵泡丟失的最主要原因。壽胎丸可能因?yàn)椴荒芗铀僮泽w卵巢移植后的血管重建，從而在提高自體移植卵巢成活率、促進(jìn)內(nèi)分泌功能恢復(fù)等方面療效不明顯。

3.3 壽胎丸對(duì)異體卵巢移植大鼠E2 分泌的影響

唐麗麗等［2］研究發(fā)現(xiàn)，壽胎丸有助于異體卵巢移植術(shù)后卵巢的成活，促使移植卵巢恢復(fù)內(nèi)分泌功能。本課題研究發(fā)現(xiàn)，卵巢移植術(shù)后，異體移植+CsA 組、異體移植+CsA +壽胎丸組的E2水平高于異體移植模型組和異體移植+ 壽胎丸組(P＜0.05)，異體移植+CsA +壽胎丸組的E2水平高于異體移植+CsA 組(P＜0.05)，說(shuō)明異體卵巢移植大鼠，應(yīng)用CsA 和壽胎丸抗排斥后，移植卵巢內(nèi)分泌功能恢復(fù);壽胎丸與CsA 有協(xié)同作用，二者聯(lián)合使用，可更好地逆轉(zhuǎn)移植后的急性排斥反應(yīng)，促進(jìn)異體移植卵巢存活;單獨(dú)應(yīng)用壽胎丸的抗排斥效果并不理想。妊娠和器官移植部分相似的免疫機(jī)制，可能是壽胎丸抗移植排斥反應(yīng)起作用的基礎(chǔ)。

［1］Oktay K，Newton H，Aubard Y，et a1. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue:an emerging technology［J］.Fertil Steril，1998，69(1):1－7.

［2］唐麗麗，羅頌平. 壽胎丸抗大鼠同種異體卵巢移植模型急性排斥反應(yīng)的研究［J］. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27(10):2098－2101.

［3］周英，葉敦敏. 壽胎丸合失笑散治療腎虛血瘀型先兆流產(chǎn)的臨床療效觀察［J］. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23(1):25－29.

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