黃彩玲 肖柳英 潘競鏘

1.廣東省從化市中心醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州 510900;2.廣東省廣州市中醫(yī)醫(yī)院 (中醫(yī)中藥研究所)，廣東 廣州 510130

水飛薊素對小鼠肝損傷保護作用及機理研究

黃彩玲1肖柳英2潘競鏘2

1.廣東省從化市中心醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州 510900;2.廣東省廣州市中醫(yī)醫(yī)院 (中醫(yī)中藥研究所)，廣東 廣州 510130

目的:探討水飛薊素對小鼠免疫性肝炎及實驗性肝損傷保護作用。方法:小鼠iv卡介苗 (BCG)5×106個菌/鼠;11天后再iv脂多糖 (LPS)7.5pg/只，造成免疫性肝炎模型及對小鼠四氯化碳 (CCL4)和硫代硫酰胺 (TAA)所引起實驗性中毒模型;觀察水飛薊素對免疫性肝炎及四氯化碳和硫代硫酰胺致實驗性肝損傷小鼠的保護作用。結果:水飛薊素和聯苯雙酯兩藥能明顯降低免疫性肝炎及實驗性肝損傷模型小鼠血清谷丙氨酸轉氨酶 (ALT)，谷草轉氨酶 (AST)的作用 (P＜0.01);血清的超氨化物岐化酶 (SOD)的活性升高、丙二醛及機理 (MDA)和一氧化氮 (NO)含量明顯降低。結論:水飛薊素對小鼠免疫性肝炎及實驗性肝損傷有保護作用。

水飛薊素;免疫性肝炎;實驗性肝損傷

水飛薊 (Silybum marianum L.Gaertn)，是菊科水飛薊屬草本植物，原產于南歐、北非［1］。水飛薊是歐洲民間的一種草藥，用于治療肝膽疾病。我國早在20世紀50年代初就引入了水飛薊，但僅用于觀賞，直到20世紀60年代末以H.Wagner為代表的德國藥學家，對其有效成分進行提取后，我國才將它作為一種保肝藥用植物推廣種植。其中，以水飛薊賓含量最高，活性也最強。它具有保肝［2］降血脂、抗氧化［3］。為此，我們進一步探討水飛薊素對小鼠免疫性肝炎及急性肝損傷的藥理學機理的影響及預防和治療作用的可能性，現報道如下。

1 材料

1.1 動物 NIH小鼠，體質量20±1.6g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供;SD大鼠:使用許可證SYXK［粵］2008－0002生產許可證SCXK［粵］2008－0002。

1.2 藥物 水飛薊素由江蘇中興藥業(yè)有限公司出品，批號20070303?？ń槊?(BCG):由廣東省結核病防治研究所生產，批號:20080613－7。脂多糖 (LPS)由晶美生物工程廣州分公司產品。硫代乙酰胺 (TAA)分析純，由中國醫(yī)藥 (集團)上?；瘜W試劑公司提供，批號:20070315。四氯化碳 (CCL4)分析純，由廣州市新港化工有限公司提供，批號:2007028?；ㄉ陀煞吓d油脂有限公司提供，產品標準號GB153486生產，批號:2008028。聯苯雙酯由廣州市市橋藥業(yè)有限公司 (原市橋制藥廠)生產，批號:080812。丙二醛 (MDA)測定試劑盒由南京建成生物所生產，批號:20080716。超氧化物歧化酶 (SOD)測定試劑盒由南京建成生物所生產，批號:20080413。一氧化氮(NO)測定試劑盒由南京建成生物所生產，批號:20080403。

1.3 儀器 BIO－TEK ELX－800酶標儀;日本奧林巴斯AU－400－生化分析儀。

2 實驗方法［4－5］

2.1 水飛薊素對小鼠免疫性肝炎的保護作用 取NIH小鼠100只，雌雄各半，分成5組:正常對照組，空白模型組，聯苯雙酯組 (150mg/kg·d)，水飛薊素高劑量組 (0.3g/kg·d)，水飛薊素低劑量組 (0.15g/kg·d)。各組小鼠分別以0.2 ml/10g灌胃給藥 (正常對照組和模型對照組小鼠用等量的蒸餾水灌胃)，每天灌胃1次，連續(xù)給藥11d。同時，除正常對照組外，其余4組小鼠在灌胃給藥的當天在小鼠尾分別靜脈注射 (iv)BCG 5×106個菌/鼠;在第11天末次給藥前的16小時靜脈注射 (iv)脂多糖 (LPS)7.5ug/鼠，造成免疫性肝炎模型，以觀察水飛薊素對小鼠免疫性肝炎的保護作用。在給藥的第12天全部小鼠眼眶放血，離心血清，測定ALT、AST、SOD、MDA、NO等生化指標。

2.2 水飛薊素對四氯化碳 (CCL4)致急性肝損傷小鼠的保護作用 取NIH小鼠100只，雌雄各半，分成5組:正常對照組，空白模型組，聯苯雙酯組 (150mg/kg·d)，水飛薊素高劑量組 (0.3g/kg·d)，水飛薊素低劑量組(0.15g/kg·d)。各組小鼠分別以0.2 ml/10g灌胃給藥 (正常對照組及空白模型組分別灌胃等量的蒸餾水)，每天灌胃1次，連續(xù)給藥8d。在第8天給藥1小時后，正常對照組腹腔注射花生油，其余4組小鼠分別以0.1ml/10g進行腹腔注射0.1%四氯化碳，造成急性肝損傷模型，以觀察水飛薊素對CCL4致急性肝損傷小鼠的保護作用。各組小鼠在染毒20小時后，眼眶放血，離心血清，分別測定ALT、TP、GLB、AST生化指標與SOD、NO和MDA含量。

2.3 水飛薊素對硫代乙酰胺 (TAA)致急性肝損傷小鼠的保護作用 取NIH小鼠100只，雌雄各半，動物分組，給藥方法、劑量及時間同實驗方法2.2。末次給藥1h后，除正常對照組腹腔注射花生油 (0.5ml/只)外，其余各組分別進行腹腔注射TAA(50mg/kg)0.5ml/只，造成急性肝損傷模型，以觀察水飛薊素對TAA致急性肝損傷小鼠的保護作用。各組小鼠在染毒20小時后，眼眶取血，離心血清，分別測定ALT、ALB、AST、TP、MDA、SOD和NO含量。

3 結果

3.1 水飛薊素對小鼠免疫性肝炎的保護作用 正常對照組的SOD、NO和MDA含量與空白模型組比較差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)，說明本實驗的造模是成功的。水飛薊素的高、低劑量組及聯苯雙酯組均能降低致免疫性肝炎模型小鼠血清的ALT、AST和ALB活性的升高， (P＜0.01);但TP沒有差異，血清SOD活性升高，血清MDA和NO的含量明顯降低。結果見表1。

表1 水飛薊素對小鼠免疫性肝炎保護作用 (±SD)

表1 水飛薊素對小鼠免疫性肝炎保護作用 (±SD)

注: 同模型組比較，＊P＞0.05，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量(g/kg·d)ALT(IU·L－1)AST(IU·L－1)TP(g·L－1)ALB(g·L－1)MDA(U/nnol)SOD(U/ml)NO(μmol/g pro)10.12±0.55模型組 144.52±1.55 172.21±5.02 42.89±3.23 18.88±2.32 36.52±1.25 94.11±4.55 30.66±1.80聯苯雙酯 0.15 81.23±12.43＊＊ 113.11±2.23＊＊ 59.91.±5.23 28.42±4.12＊＊ 18.12±0.42＊＊167.15±5.33＊＊＊18.73±0.71＊＊＊水飛薊素高劑量 0.30 91.32± 2.12＊＊ 129.21±2.13＊＊ 51.47.±3.33 27.31±3.22＊＊ 22.21±3.54＊＊138.77±29.72＊＊20.94±0.21＊＊＊水飛薊素低劑量 0.15 99.13± 2.13＊＊133.14±3.11＊＊ 57.12±8.66 31.21±5.52＊＊ 24.06±3.02＊＊ 151.24±5.21＊＊ 24.89±1.21對照 86.20±1.53＊＊ 110.22±3.12＊＊ 66.51±2.31 34.12±0.86 21.21±0.32 127.62±6.55*＊＊

3.2 水飛薊素對CCL4致急性肝損傷小鼠的保護作用 正常對照組的SOD、NO和MDA含量與空白模型組比較差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)，說明本實驗的造模是成功的;各組小鼠血清中AL T和A ST活性變化CCl4模型組的ALT和AST活性較正常對照組明顯升高 (P＜0.01)，與模型組比較，ALT和AST活性均有明顯下降 (P＜0.01)。水飛薊素高、低劑量組及聯苯雙酯組均能明顯降低CC14急性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST和GLB(P＜0.01)，但TP沒有差異，血清MDA和NO含量的明顯降低，血清的超氧化物歧化酶 (SOD)的活性均升高，結果見表2。

表2 水飛薊素對CCL4小鼠急性肝損傷的實驗研究(+SD)

表2 水飛薊素對CCL4小鼠急性肝損傷的實驗研究(+SD)

組別 劑量(g/kg·d)ALT(IU·L－1)AST(IU·L－1)TP(g·L－1)ALB(g·L－1)MDA(U/nnol)SOD(U/ml)NO(μmol/g pro)對照組 375.62±10.42＊＊ 283.8±213.12＊＊ 49.31±4.5* 14.44±3.94 14.52±2.20 37.92±22.63＊＊＊ 9.81±0.41＊＊模型組 662.02±121.52 741.77±110.32 47.23±4.31 19.61±2.51 24.97±4.31 28.52±11.31 49.01±25.13聯苯雙酯 0.15 314.20±121.13＊＊ 384.7±235.21＊＊36.87±3.77* 9.96±2.42* 10.85±3.21＊＊81.74±13.66＊＊＊19.95±0.42＊＊水飛薊素高劑量 0.30 362.23± 124.12＊＊ 492.7±111.80＊＊50.21±2.44* 11.62±2.33* 13.42±4.21＊＊68.72±13.31＊＊ 21.51±1.76＊＊水飛薊素低劑量 0.15 389.21± 102.10＊＊ 476.1±162.31＊＊57.32±2.32* 13.77±2.33＊＊ 14.94±5.25＊＊ 62.21±6.21＊＊ 25.27±1.12＊＊

注:同模型組比較，＊P＞0.05，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

表3 水飛薊素對TAA小鼠急性肝損傷的實驗研究 (+SD)

表3 水飛薊素對TAA小鼠急性肝損傷的實驗研究 (+SD)

注: 同模型組比較，＊P＞0.05，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量(g/kg·d)ALT(IU·L－1)AST(IU·L－1)TP(g·L－1)ALB(g·L－1)MDA(U/nnol)SOD(U/ml)NO(μmol/g pro)對照組 88.83±3.18＊＊＊＊＊ 97.56±9.45＊＊＊ 60.22±4.77* 28.82±2.44 15.75±4.41＊＊71.26±7.71＊＊＊ 7.88±0.31＊＊模型組 369.73±42.16 251.70±45.34 54.84±2.32 19.49±1.83 30.94±2.18 37.45±4.31 38.83±2.52＊＊＊聯苯雙酯 0.15 98.12±54.77＊＊＊＊ 142.42±38.22＊＊59.66±3.44* 23.96±2.88＊＊ 13.84±3.48＊＊79.73±7.84＊＊＊ 17.82±1.24＊＊水飛薊素高劑量 0.30 104.31± 43.13＊＊＊ 167.31±34.23＊＊ 58.73±2.43 32.75±5.32＊＊ 18.72±3.74＊＊ 62.42±6.48＊＊ 29.61±1.62＊＊水飛薊素低劑量 0.15 116.52± 43.23＊＊ 176.42±31.42＊＊ 63.51±3.72 35.42±5.62＊＊＊＊19.83±4.34＊＊ 69.94±6.34＊＊ 31.52±1.51＊＊

3.3 水飛薊素對TAA致急性肝損傷小鼠的保護作用 正常對照組的SOD、NO和MDA含量與空白模型組比較差異顯著 (P＜0.01)，說明本實驗水飛薊素對TAA致急性肝損傷小鼠的造模是成功的。水飛薊素高、低劑量組及聯苯雙酯組均能明顯降低 TAA急性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST和GLB(P＜0.001)，但TP沒有差異，血清MDA和NO含量的明顯降低，血清的超氧化物歧化酶SOD的活性均升高。結果見表3。

4 討論

免疫性肝炎與用化學物質造成的肝損傷的動物模型比較，在病理機制上更接近人體的肝炎。陳奇［6］治療肝炎的中藥的藥效學研究，有各種經典的動物模型。韓永輝等［7］用CCl4引起肝細胞損傷時，破壞了膜的結構，肝細胞內的多種酶可透過肝細胞膜到肝竇狀隙，進入血液，使血中的多種酶活性增高，由于轉氨酶是肝細胞損傷最敏感的指標之一。因此，轉氨酶升高，在一定程度反映了肝細胞損害的程度。

促進肝細胞修復、再生水飛薊素進入肝細胞后可與雌二醇受體結合并使之激活，活化的受體則可增強肝細胞核內RNA聚合酶I的活性，使核糖體RNA轉錄增強，細胞內核糖體數目增多，促進酶及結構蛋白的合成，并間接促進DNA的合成，有利于肝細胞修復，再生。這種作用可見于受傷的肝細胞及肝切除后剩余的肝細胞，而未見于正常肝細胞及多種惡性腫瘤細胞［8］。Ph ilippe等人［11］報道水飛薊素對CCl4誘導的脂質過氧化的保護作用，并討論了作用機制，指出水飛薊素具有防止CCl4的代謝激活生成的自由基和對這些自由基有清除作用。水飛薊素能使CCl4對脂質的共價結合明顯減少，CCl4所致的脂質過氧化被水飛薊素減少72%。水飛薊賓為抗氧自由基活性物質，其抗脂質過氧化的作用已經被實驗證實。水飛薊賓具有防止CCl4誘導的脂質過氧化作用，即能減少并清除CCl4的代謝激活生成的自由基。還有認為水飛薊賓能使CCl4對脂質的共價結合明顯減少［12］。水飛薊賓能促進細胞DNA及結構蛋白等的合成，從而促進肝細胞修復和再生。SPC是我室自行合成的水飛薊賓與磷脂酰膽堿的分子型復合物，具有較好的生物利用度，并且復合物中所含磷脂酰膽堿也具有抗自由基活性、抗脂質過氧化作用［13］。

實驗結果表明:水飛薊素高、低劑量組有促進免疫性肝損傷和急性肝損傷血清ALT、AST恢復的作用，提示該藥具有穩(wěn)定肝細胞膜作用，主要的機制可能是水飛薊素有清除自由基，抑制脂質過氧化，抑制肝組織MDA的升高，阻止SOD的耗竭，提高SOD的活性，說明水飛薊素對免疫性肝損傷和急性肝損傷所致小鼠急性肝損傷有明顯的保護和治療作用，能明顯減輕所致小鼠肝損傷程度。從而避免肝細胞的損害，起到保護肝細胞的作用。我們利用這一模型研究證實水飛薊素對免疫性肝炎和急性肝損傷具有很好的拮抗和保肝護肝的作用。

近年來，由于水飛薊素顯示出保肝和抗氧化以外的活性而備受關注，其中水飛薊素表現出的抗癌和腫瘤預防作用已經顯示出很好的開發(fā)潛力。它被廣泛應用于醫(yī)藥、保健品、食品和化妝品等產品中。被稱為“天然的保肝藥”;作為強抗氧化劑，能夠清除人體內的自由基，延緩衰老。因此我們若能積極開發(fā)生物利用度高，臨床療效好的水飛薊素類制劑，對于開發(fā)新型抗肝病藥物并擴大其臨床應用范圍具有非常重要的意義。

［1］西安植物園中草藥研究組.水飛薊［J］.中草藥通訊，1973，(6):28～35.

［2］柯銘清.中草藥有效成分理化與藥理特性［M］.長沙:湖南科學技術出版社，1982:266.

［3］閆玉峰，于建東.水飛薊化學成分及藥理研究進展［J］.中國藥事，2000，14(5):335～337.

［4］張丹，林培英，肖柳英，等.健肝靈膠囊對小鼠免疫性肝炎的影響［J］.中成藥，2000，22(5):356－357.

［5］肖柳英，潘競鏘，饒衛(wèi)農，等.荔枝核顆粒對小鼠肝損傷保護作用的實驗研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志 (原中國中醫(yī)藥學報)，2005，20(1):42.

［6］陳奇.中藥藥理學實驗方法［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1993:725.

［7］韓永輝，呂東霞，盧秉久.中藥復肝解毒沖劑對四氯化碳所致大鼠急性肝損傷保護作用的實驗研究［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2008，26(5):1074－1075.

［8］ Leng － Peschlow E，strenge － Hesse A.The milk thistle and silyma2 rin as hepatic therapeutic agents［J］.Phytotherap ie，1991，12(1):1621.

［9］ Ph ilipp e L，et al.Biochem Pharm aco l，1993，29:2209.

［10］孫鐵民，李銑.水飛薊素藥理研究進展［J］.中草藥，2000，31(3):229－230.

［11］徐承水，衣艷君.磷脂酰膽堿對小鼠過氧化損傷的保護作用［J］.中國現代應用藥學雜志，2001，18(5):375－376.

The study of Prorection effect of model silmyarin on hepatic injured in mice

HUANG cai－ling1，XIAO liu－ying2，PAN jing－qiang2
1.Department of Pharmacy，Cong Hua Central Hospital of Guangzhou，Guangzhou 510900，China;2.Guangzhou Hospital Traditional Chinese medicine(Guangzhou institute of traditional Chinese Medicine and Materia Medica)，Guangzhou 510130，China

Objective:To observe the study the effect prorection of model silmyarin on Immunological hepatitis and experimental hepatotoxicity in mice.Mothods:The mouse model of immunological hepatits was established by intravenously injecting of BCG(5×106bacilli/mouse)and after 11 days intravenously injecting of lipopdysaccharide(7.5μg/mouse)and experimental hepatotoxicity mice model induced by Carbon Tetrchloride(CCL4)and Thioacetamide(TAA).The research of effect Prorection of machemism silmyarin on Immuological Hepatitis and experimental hepatotoxicity in mice.Results:The effected of silmyarin significantly decrease the liver of serum ALT、AST in mouse immulogical hepatitis model.The silmyarin could obviously increase the activity by SOD in serum of mice and the content of MDA could obviously decrease of serum.Conlusious:silmyarin could frotect mice from immunological liver injury and experimental hepatotoxicity.

silmyarin;immunological hepatitis;experimental hepatotoxicity

R965.2

A

1007－8517(2012)15－0036－03

2012.05.27)