吳 春 陳林林 李俊生

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076)

黑大豆種皮花色苷對(duì)亞硝胺體內(nèi)外合成的阻斷作用

吳 春 陳林林 李俊生

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076)

在模擬人體胃液的條件下，通過(guò)測(cè)定N－二甲基亞硝胺(NDMA)的阻斷率、NO2－的形成量和清除率，研究了黑大豆種皮花色苷(BSCA)體外對(duì)亞硝化反應(yīng)的抑制活性;以血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶為測(cè)定指標(biāo)，通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)考察了BSCA體內(nèi)對(duì)亞硝胺合成的阻斷作用。結(jié)果表明，BSCA能明顯阻斷亞硝胺的化學(xué)合成，其最大阻斷率為85.9%，對(duì)亞硝酸鈉具有較好的清除活性，最大清除率為70.4%;其對(duì)硝酸鹽還原酶還原NO3－為NO2－的抑制率可達(dá)53.7%。體內(nèi)阻斷亞硝胺合成的實(shí)驗(yàn)中，BSCA組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。BSCA對(duì)亞硝胺的體內(nèi)外合成均具有較強(qiáng)的阻斷作用。

黑大豆種皮 花色苷 亞硝胺 阻斷作用 體內(nèi)外

N－亞硝胺(NDMA)是一類強(qiáng)致癌物，它能引起人和動(dòng)物胃、肝臟等多種臟器的惡性腫瘤。正常情況下人們直接從食物中攝入亞硝胺的量微乎其微，但形成NDMA類的前體物質(zhì)硝酸鹽或亞硝酸鹽卻廣泛存在于食物及產(chǎn)生于食物在體內(nèi)的代謝過(guò)程中，特別是亞硝酸鹽在胃液中更易合成NDMA［1－3］。因此，阻斷NDMA合成和清除其前體亞硝酸鹽是防癌抗癌的有效途徑。

黑大豆是傳統(tǒng)的藥食兼用的農(nóng)產(chǎn)品資源，其種皮富含花色苷類化合物，是天然色素的重要來(lái)源。目前對(duì)黑大豆種皮花色苷(black soybean coat anthoc－yanin，BSCA)的研究多集中在化學(xué)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、抗氧化、清除自由基等方面［4－8］，而對(duì)亞硝化反應(yīng)的抑制活性方面的研究卻鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以黑大豆為原料提取花色苷，研究其體內(nèi)外清除亞硝酸鈉及對(duì)亞硝胺合成的阻斷作用，為尋找安全有效且具有較高食用和藥用價(jià)值的亞硝化反應(yīng)抑制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

黑大豆種皮:市售黑龍江省綏化市產(chǎn)黑大豆，手工剝?nèi)》N皮，干燥后粉碎過(guò)60目篩，備用。

昆明種小鼠:由黑龍江省腫瘤研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

氨基比林:錦州九州藥業(yè);谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒:南京建成生物工程研究所;硝酸鹽還原酶提取液:實(shí)驗(yàn)室自制;醋酸鋅、無(wú)水乙醇等試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

721紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):上海光譜儀器有限公司;XT220A電子天平:瑞士普利塞斯;W202B升降恒溫水浴鍋:上海申勝生物技術(shù)有限公司;PHS－25型酸度計(jì):上海偉業(yè)儀器廠;UV－VI紫外透射分析儀:北京智源通生物技術(shù)研究所。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑大豆種皮花色苷的制備

取一定量黑大豆皮，按料液比為1∶30(g/mL)加入60%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液混合均勻，用0.5 mol/L HCl將溶液pH調(diào)至3，在70℃浸提1 h，過(guò)濾，收集濾液;將濾渣按同樣的條件重復(fù)浸提2次過(guò)濾，合并3次濾液于50℃下減壓濃縮得到棕紅色黏稠的粗提液。粗提液用AB－8大孔樹(shù)脂分離純化，上樣pH值為1，上樣量與樹(shù)脂的體積比為8∶1，按1 mL/min的流速上柱，靜置50 min后，采用70%的乙醇溶液作為洗脫劑，洗脫液量與樹(shù)脂體積比為8∶1。洗脫物經(jīng)真空冷凍干燥成粉，試驗(yàn)前用雙蒸水配成所需濃度。

1.3.2 體外阻斷NDMA合成的濃度梯度試驗(yàn)

在模擬人體胃液的條件下，二甲胺與亞硝酸鈉在37℃條件下，可適宜地生成二甲基亞硝胺，當(dāng)往BSCA中依次加入二甲胺與亞硝酸鈉時(shí)，BSCA優(yōu)先同亞硝酸鈉作用，使得二甲胺不能與亞硝酸鈉反應(yīng)，達(dá)到阻止亞硝胺生成的目的。據(jù)此可以比較相同條件下生成亞硝胺量的多少來(lái)反映BSCA阻斷能力的強(qiáng)弱，生成亞硝胺量少，阻斷能力就強(qiáng)，反之則弱。

在紫外光照射下，二甲基亞硝胺可分解成二甲基仲胺和亞硝酸根，亞硝酸根與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，再與α－萘胺偶合生成紅色化合物。用分光光度計(jì)測(cè)出該化合物的吸光度值可計(jì)算上述反應(yīng)液中亞硝胺含量的多少。

精確稱取BSCA 0.1 g用少量蒸餾水溶解，定容至100 mL，質(zhì)量濃度為0.001 g/mL，作為測(cè)試液。

準(zhǔn)確吸取 BSCA 測(cè)試液各 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4.0 mL 于 25 mL 比色管中，分別加入 pH 3.0的檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液5 mL，1 mmol/L NaNO2溶液 0.5 mL，再加入 1 mmol/L二甲胺0.5 mL，用蒸餾水定容至刻度，在37℃下恒溫1 h。用移液管吸取1.0 mL上述反應(yīng)液到70 mm的培養(yǎng)皿中，加入0.5%的 Na2CO3溶液0.5 mL，于黑布遮蓋的紫外分析儀上照射15 min，取出后加入1%的對(duì)氨基苯磺酸和0.1%的a－萘胺溶液各1.5 mL，加水至溶液精確體積為5.0 mL，然后搖勻放置15 min后，用分光光度計(jì)在525 nm處測(cè)吸光度值(Ax)，同時(shí)做空白試驗(yàn)(A0)，計(jì)算阻斷率。

阻斷率=(A0－Ax)/A0×100%

1.3.3 體外清除NaNO2的濃度梯度實(shí)驗(yàn)

亞硝酸鹽在弱酸性的條件下，能與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合生成紅色的化合物。準(zhǔn)確吸取 BSCA 測(cè)試液各 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4.0 mL 于 25 mL 比色管中，分別加入5 mg/L的 NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液 2.0 mL，pH 3.0 的檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液5 mL，用蒸餾水定容至刻度，在37℃下恒溫1 h。用移液管吸取1.0 mL反應(yīng)溶液到70 mm的培養(yǎng)皿中，加入 0.4%對(duì)氨基苯磺酸2.0 mL，搖勻靜置5 min，再加入0.2%鹽酸萘乙二胺1.0 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻靜置15 min。在確定的最大吸收波長(zhǎng)λmax=540 nm處測(cè)定吸光度(Ax)，同時(shí)做空白試驗(yàn)(A0)，計(jì)算清除率。

清除率=(A0－Ax)/A0×100%

1.3.4 抑制硝酸鹽還原酶還原NO－3為NO－2試驗(yàn)

取 0.001 g/mL BSCA 測(cè)試液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4.0 mL 和 1.0 mol/L 的硝酸鈉1.0 mL分別加入25 mL比色管中，用蒸餾水補(bǔ)充至9.0 mL，再加入1.0 mL硝酸鹽還原酶提取液后放入37℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，取出立即加入0.8%對(duì)氨基苯磺酸1.0 mL，0.5% α － 萘胺 1.0 mL，室溫下反應(yīng)15 min后比色，測(cè)定吸光度，按繪制的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線(c=8.251 8 A －1.347 7，R=0.995。式中:c為亞硝酸鈉溶液的濃度/μg/mL;A為吸光度值;R為相關(guān)系數(shù))計(jì)算NO－2的形成量，并以此來(lái)計(jì)算其抑制率。

抑制率IR=(N空－N樣)/N空

式中:N空、N樣分別為未加入BSCA和加入BSCA的NO－2的形成量。

1.3.5 體內(nèi)阻斷亞硝胺合成試驗(yàn)

健康68周齡小鼠，體重18～22 g，雌雄各半，適應(yīng)環(huán)境喂養(yǎng)一周后按體重隨機(jī)分成正常組，對(duì)照組，BSCA高、中、低劑量組，每組10只。對(duì)照組灌胃亞硝酸鈉和氨基比林混合液10 mL/(kg·d)(10 mL內(nèi)含27.3 mg 亞硝酸鈉和 81.9 mg氨基比林)，BSCA高、中、低劑量組灌胃亞硝酸鈉和氨基比林和不同量的BSCA的混合液10 mL/(kg·d)，正常組灌胃同體積0.9%生理鹽水，每天灌胃一次，共5 d，第6天摘取眼球取血，2 500 r/min離心20 min分離制備血清，用賴氏法在505 nm下測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量。

2 結(jié)果分析

2.1 黑豆皮花色苷的提取及純化后得率

由20 g黑豆皮粉末按1.3.1方法對(duì)黑豆皮中花色苷進(jìn)行提取及純化，經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)濃縮，真空干燥后分別得酒紅色粉末，測(cè)定粉末質(zhì)量，計(jì)算出提取及純化后黑豆皮花色苷的得率見(jiàn)表1。

表1 黑豆皮花色苷得率

2.2 體外對(duì)NDMA合成的阻斷作用

BSCA體外對(duì)NDMA合成的阻斷作用結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 BSCA對(duì)NDMA合成的阻斷作用

由圖1可以看出，BSCA對(duì)NDMA合成具有明顯的阻斷作用，隨著樣液濃度的增加，BSCA對(duì)NDMA合成的阻斷率出現(xiàn)明顯的梯度變化，當(dāng)加樣量在0.5 ～2.5 mL 時(shí)，阻斷率由 44.2%上升至 74.6%，隨著加樣量的增加其作用增強(qiáng)，當(dāng)加入量達(dá)到3 mL后，阻斷能力基本不變。說(shuō)明BSCA可有效地阻斷亞硝胺的合成。最大阻斷率可達(dá)85.9%，出現(xiàn)在加樣量為4 mL處。

2.3 體外對(duì)亞硝酸鈉的清除作用

BSCA體外對(duì)NaNO2的清除作用結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 BSCA對(duì)NaNO2的清除作用

由圖2可以看出，BSCA對(duì)NaNO2的清除作用效果與其濃度成正相關(guān)關(guān)系。隨BSCA取樣量的增加，其對(duì)亞硝酸鈉的清除率逐漸增加，當(dāng)加樣量達(dá)到2.5 mL后，再繼續(xù)增加BSCA，清除率變化很小。這時(shí)清除率最大可達(dá)70.4%，說(shuō)明BSCA可有效地清除亞硝酸鈉。

2.4 抑制硝酸鹽還原酶還原NO－3為NO－2試驗(yàn)

食物中硝酸鹽在人體內(nèi)經(jīng)存在于胃液內(nèi)的多種硝酸鹽還原菌(含有硝酸鹽還原酶)作用轉(zhuǎn)變成亞硝酸鹽，從而成為在體內(nèi)形成亞硝胺的前體物質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果表明BSCA具有抑制硝酸鹽還原酶還原NO－3為NO－2的作用，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 BSCA對(duì)硝酸鹽還原酶還原NO－3為NO－2的抑制作用

由圖3可以看出，在BSCA添加量在0.5～3.5 mL范圍內(nèi)時(shí)，隨著B(niǎo)SCA加入量的增大，對(duì)硝酸鹽還原酶還原NO－3為NO－2的抑制率逐漸增大。隨后增大加入量抑制率不再改變，其最大抑制率為53.7%。

2.5 體內(nèi)對(duì)NDMA合成的阻斷作用

以血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶為指標(biāo)測(cè)定，考察BSCA體內(nèi)阻斷NDMA合成的作用效果，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2數(shù)據(jù)可知，給藥組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶較對(duì)照組明顯降低，其中高劑量組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶接近正常組，且BSCA的濃度與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的量存在劑量效應(yīng)關(guān)系。

表2 黑大豆種皮花色苷體內(nèi)阻斷N－二甲基亞硝胺合成的效果(x±s，n=10)

3 討論與結(jié)論

通過(guò)對(duì)BSCA體內(nèi)外抑制亞硝化反應(yīng)的活性研究，表明BSCA能清除亞硝酸鈉、阻斷亞硝胺的合成和明顯降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量。由于在體內(nèi)酸性環(huán)境中，亞硝酸鹽與仲胺合成亞硝胺，亞硝胺通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入肝細(xì)胞中，破壞肝細(xì)胞，致使肝組織中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入血液中。而B(niǎo)SCA正是通過(guò)清除亞硝酸鹽來(lái)阻斷亞硝胺的合成，從而起到保護(hù)肝組織免受亞硝胺的侵害，降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用。黑大豆資源豐富，研究其在防癌方面的作用具有較好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

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Inhibition of Nitrosamine Synthesis by Black Soybean Coat Anthocyanin in Vivo and Vitro

Wu Chun Chen Linlin Li Junsheng
(Key Laboratory of Food Science and Engineering，College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076)

The activity of black soybean coat anthocyanins(BSCA)on inhibiting nitrosation was studied by measuring the blocking rate on synthesis of N－nitrosodimethylamine，formation rate and clearance rate of NO2and providing simulated test human gastric juice conditions.The in vivo activity of blocking synthesis of nitrosamine was investigated by taking animal experiment，and taking serum GPT as a test index.The results showed that BSCA had obvious capability of blocking chemical nitrosamine synthesis.The maximum blocking rate of NDMA was 85.9%，the activity of scavenging sodium nitrite was relatively good.The maximum eliminating rate of nitrite sodium was 70.4%.BSCA can prohibit 53.7%of the reducing of nitrate reductase(from NO3－to NO2－).During the process of blocking synthesis of nitrosamine，the serum GPT in BSCA group was significantly lower than that in control group(P ＜0.01).BSCA has strong inhibiting effect on blocking nitrosamine synthesis in vivo and vitro.

black soybean coat，anthocyanin，nitrosamine，inhibition，vivo and vitro

TS202.3

A

1003－0174(2012)01－0025－04

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(12511z010)

2011－04－07

吳春，女，1962年出生，教授，食品化學(xué)