張 楓

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025; 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱50001)

李江南，尹曼曼，郭東偉 劉琴芳，王朝，翁長(zhǎng)江

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150001)

熊 濤

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

2株豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離及其基因測(cè)序

張 楓

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025; 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱50001)

李江南，尹曼曼，郭東偉 劉琴芳，王朝，翁長(zhǎng)江

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150001)

熊 濤

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

2006年，我國(guó)爆發(fā)了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRSV)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，該HP-PRRSV在Nsp2區(qū)有30個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失。分子流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，目前我國(guó)流行的PRRSV毒株主要是HP-PRRSV毒株。2011年，從山東某豬場(chǎng)成功分離到2株P(guān)RRSV，分別命名為PRRSV-SDA2和PRRSV-SDA3；基因測(cè)序結(jié)果顯示PRRSV-SDA2全長(zhǎng)為15349bp，PRRSV-SDA3全長(zhǎng)為15350bp。通過(guò)與涵蓋歐洲型和北美型的24個(gè)毒株全基因比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)毒株均屬于北美型HP-PRRSV，與HuN4毒株的同源性最高，均高達(dá)99.5%，其N(xiāo)SP2蛋白的482和533～561位缺失了30個(gè)氨基酸。成功分離的SDA2和SDA3 2個(gè)HP-PRRSV及完成的基因測(cè)序，為構(gòu)建HP-PRRSV毒株的感染性克隆奠定了基礎(chǔ)。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)；分離與鑒定；基因測(cè)序；NSP2

豬繁殖與呼吸綜合癥(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的傳染性疾病，主要特征是懷孕母豬出現(xiàn)繁殖障礙以及各年齡段豬的呼吸道癥狀[1-2]。PRRSV屬于套式病毒目動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)，同一屬的病毒還有猴出血熱病毒(SHFV)、馬動(dòng)脈炎病毒(EAV)和小鼠乳酸脫氫酶升高癥病毒(LDV)。

1987年美國(guó)首次出現(xiàn)PPRS[3]，1991年荷蘭首先分離到PRRS相關(guān)病原，并命名為L(zhǎng)elystad virus(LV)[4-5]。1992年美國(guó)分離到PRRS相關(guān)病原，命名為VR-2332[6]。分析發(fā)現(xiàn)，LV與VR-2332的同源性僅為50%～60%[7]。雖然后來(lái)許多國(guó)家都分離到PRRSV，但都是這2種PRRSV的變異型，因此病毒學(xué)上把LV和VR-2332作為PRRSV的2種原型株，其中LV代表的是歐州型(基因Ⅰ型)，VR-2332代表的是北美型(基因Ⅱ型)。郭寶清等[8]1996年從4頭流產(chǎn)胎兒中分離到PRRSV，首次證實(shí)中國(guó)也存在PRRSV。2006年，在我國(guó)南方一些省份爆發(fā)了一種以體溫高、發(fā)病率高以及高死亡率的豬“高熱綜合癥”，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。后證實(shí)引起該病的病原為北美型PRRSV的變異株，稱為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)，該變異毒株在NSP2蛋白的482、533～561位共有30個(gè)氨基酸的缺失[10-11]。

目前，中國(guó)主要流行的是北美型毒株，偶爾也有分離到歐洲型毒株的報(bào)道。近幾年國(guó)內(nèi)許多研究人員對(duì)PRRSV進(jìn)行了分子流行病學(xué)的跟蹤分析和潛在演變分析，如安同慶等[9]對(duì)國(guó)內(nèi)67株P(guān)RRSV基因序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)我國(guó)PRRSV分為4個(gè)亞群，HP-PRRSV是其中的一個(gè)亞群，演化分析初步證明HP-PRRSV起源于CH-1a樣PRRSV，且變異是漸進(jìn)的。2011年，山東某豬場(chǎng)出現(xiàn)母豬大規(guī)模的流產(chǎn)癥狀，臨床診斷疑似高致病性豬藍(lán)耳病引起的疫情。本研究從采集到的血樣中分離到2株病毒，通過(guò)間接免疫熒光和病毒的基因序列測(cè)定及病毒感染的臨床癥狀、遺傳進(jìn)化分析，判斷這2株P(guān)RRSV為HP-PRRSV。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)病料、細(xì)胞和引物

實(shí)驗(yàn)病料為豬血液，來(lái)自山東某豬場(chǎng)。該豬場(chǎng)自2011年8月份來(lái)出現(xiàn)了典型“高熱癥”，發(fā)病率高且出現(xiàn)急性死亡，RT-PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性，分離的2個(gè)毒株分別命名為PRRSV-SDA2和PRRSV-SDA3。Marc-145細(xì)胞由哈爾濱獸醫(yī)研究所豬藍(lán)耳病基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室保存；基因測(cè)序所用引物參考NCBI上HuN4基因序列設(shè)計(jì)(表1)。

表1 SDA2和SDA3基因擴(kuò)增所用引物

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自GIBICO公司；病毒RNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自QIANGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScriptⅢ First-Strand購(gòu)自Invitrogen公司；Phusion High-fidelity DNA Polymerase 購(gòu)自NEW ENGLAND Biolabs公司；Peimix Ex Tag、DL15000和DL2000購(gòu)自TaKaRa公司；RACE試劑盒購(gòu)自Clontech公司；pGEM-T Easy載體購(gòu)自Promega公司；抗PRRSV核衣殼蛋白(N蛋白)由哈爾濱獸醫(yī)研究所李曦研究員饋贈(zèng)；FITC標(biāo)記羊抗鼠熒光二抗購(gòu)自Sigma公司。

1.3 病毒分離、傳代及細(xì)胞病變觀察

豬血清用0.45μm濾膜除菌，將血清10倍稀釋后接種到Marc-145細(xì)胞單層，孵育2h，換成2% FBS的DMEM。每天觀察細(xì)胞，待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變(CPE)后，反復(fù)凍融3次后收集上清，并接種到Marc-145細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)，同時(shí)拍照記錄每代CPE。

1.4 間接免疫熒光(IFA)

將第5代病毒接種Marc-145細(xì)胞，感染48h后用4%多聚甲醛固定15min，PBS洗3次，用0.3% Triton X-100處理細(xì)胞15min，10%的FBS血清封閉30min，加入抗PRRSV N蛋白單抗(1∶200)，室溫孵育2h，PBS洗3次，再加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶200)，PBS洗3次，熒光顯微鏡觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 病毒基因測(cè)序

利用QIANGEN公司病毒RNA提取試劑盒提取第5代病毒RNA，然后用SuperScriptⅢ First-Strand試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模版，用表1中的引物將病毒基因組分9個(gè)片段擴(kuò)增(除病毒5′和3′外)，PCR產(chǎn)物送北京華大基因研究中心測(cè)序。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

病毒5′和3′UTR用Clontech公司的RACE試劑盒擴(kuò)增，操作按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。擴(kuò)增片段回收后，連接pGEM-T Easy載體，然后送北京華大基因研究中心測(cè)序。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 基因序列拼接及遺傳進(jìn)化分析

利用DNAstar 5.0軟件對(duì)9個(gè)片段及病毒兩端測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，并對(duì)這2個(gè)分離株的基因進(jìn)行分析。利用MEGA4軟件統(tǒng)計(jì)分析SDA2和SDA3與其他PRRSV毒株的基因及氨基酸同源性，并用基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。實(shí)驗(yàn)所用到的參考毒株全部來(lái)自于Genbank(表2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的分離

臨床樣品接種Marc-145細(xì)胞，72h開(kāi)始出現(xiàn)CPE，而對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)良好。收集細(xì)胞凍存上清進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞在接種病毒48h后開(kāi)始出現(xiàn)CPE，隨后細(xì)胞變圓，最后從壁上脫落(圖1)。

A：SDA2在Marc-145細(xì)胞上的病變；B：SDA3在Marc-145細(xì)胞上的病變；C：對(duì)照?qǐng)D1 SDA2和SDA3感染Marc-145細(xì)胞上產(chǎn)生的CPE

A：SDA2的IFA結(jié)果；B：SDA3的IFA結(jié)果；C：對(duì)照?qǐng)D2 SDA2和SDA3在Marc-145細(xì)胞上的的間接免疫熒光結(jié)果

2.2 間接免疫熒光(IFA)鑒定

利用抗PRRSV N蛋白單克隆抗體作間接免疫熒光染色，結(jié)果顯示，接種PRRSV-SDA2和PRRSV-SDA3的Marc-145細(xì)胞在熒光顯微鏡下可以看到大量的綠色熒光(圖2 A和B)，而沒(méi)有接種病毒的對(duì)照Marc-145細(xì)胞則沒(méi)有特異熒光出現(xiàn)(圖2 C)，表明分離到的PRRSV毒株在Marc-145細(xì)胞中復(fù)制與增殖，PRRSV的核衣殼蛋白得到表達(dá)。

2.3 病毒目的片段擴(kuò)增和全序列拼接

分別提取SDA2和SDA3的第5代病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄得到其cDNA，以此為模板，通過(guò)表1的引物作PCR，成功擴(kuò)增到9個(gè)片段(圖3)，將片段回收后送北京華大基因研究中心測(cè)序。病毒基因兩端采用5′和3′ RACE方法擴(kuò)增得到特異的條帶(圖4)，連接pGEM-T載體，然后送北京華大基因研究中心測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用DNAStar 5.0軟件對(duì)SDA2和SDA3的基因序列進(jìn)行拼接，得到這2個(gè)毒株的基因序列，分別為15349bp和15350bp。

M1：DL15000 DNA Marker；1～9：RT-PCR擴(kuò)增SDA2的PCR產(chǎn)物；10：陰性對(duì)照；11～19：RT-PCR擴(kuò)增SDA3的PCR產(chǎn)物;M2:DL2000 DNA Marker圖3 SDA2和SDA3基因不同片段的RT-PCR結(jié)果

M：DL2000 DNA marker；1：PCR擴(kuò)增PRRSV SDA2的5′UTR；2：PCR擴(kuò)增PRRSV SDA3的5′UTR；3：PCR擴(kuò)增PRRSV SDA2的3′UTR；4：PCR擴(kuò)增PRRSV SDA3的3′UTR圖4 5′RACE和3′RACE擴(kuò)增SDA2和SDA3的5′UTR和3′UTR

圖5 SDA2和SDA3 PRRSV基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

2.4 遺傳進(jìn)化分析

利用MEGA 4軟件對(duì)2株新的PRRSV毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，參考毒株(表2)涵蓋歐洲型和北美型以及HP-PRRSV。同源性分析顯示，SDA2和SDA3的同源性為99.8%，與HuN4的同源性最高，為99.5%，表明這2株P(guān)RRSV與HuN4的親緣關(guān)系很近。利用這2個(gè)毒株與其他24個(gè)參考毒株的基因繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)(圖5)，結(jié)果顯示，PRRSV分為基因型Ⅰ(歐洲型)和基因型Ⅱ(北美型)，中國(guó)分離株均為北美型。北美型又分為2個(gè)亞型：以VR-2332為代表的亞群Ⅰ和以HuN4為代表的亞群Ⅱ。分離的2株P(guān)RRSV均屬于北美型中的亞群Ⅱ，與HuN4和JXA1處于同一小分支。NSP2是PRRSV變異最大的蛋白，分析發(fā)現(xiàn)SDA2和SDA3與近幾年國(guó)內(nèi)分離的HP-PRRSV一樣，在482、533～561位共有30個(gè)氨基酸的缺失。結(jié)合臨床癥狀及分離毒株的特性，可以判斷分離到的2株P(guān)RRSV為中國(guó)流行的HP-PRRSV。

2.5 序列提交

SDA2和SDA3目前已提交到Genbank上，序列登錄號(hào)分別為JX878379、JX878380。

3 討論

PRRSV為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，基因全長(zhǎng)約為15kb，具有5′帽子結(jié)構(gòu)和3′Poly(A)尾巴，包含9個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，分別是 ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b以及ORF3～ORF7，另外在5′和3′兩端還分別有1個(gè)非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)[12-13]。ORF1a和ORF1b編碼2個(gè)大的多聚蛋白pp1a和pp1b，然后水解成12種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP)，其中的NSP2是PRRSV復(fù)制酶編碼的最大蛋白，變異程度最高，是歐洲型和北美型PRRSV的主要差異蛋白，常被作為PRRSV遺傳變異的標(biāo)記。2006年中國(guó)發(fā)生新的豬繁殖與呼吸綜合征疫情，該P(yáng)RRSV毒株的NSP2蛋白中缺失了30個(gè)氨基酸[10-11,14-16]，因此推測(cè)NSP2缺失可能是造成毒力變化的主要原因[14-16]。楊漢春等[15]利用反向遺傳系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)NSP2的缺失與PRRSV毒力增強(qiáng)并無(wú)關(guān)系，因此引起PRRSV毒力的變化的機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。2011年筆者在山東分離到的2株SDA2和SDA3也均在NSP2中缺失30個(gè)氨基酸，且缺失位置和HuN4等HP-PRRSV一樣，位于482和533～561氨基酸，結(jié)合臨床癥狀及分離毒株的特性，判斷它們?yōu)橹袊?guó)流行的HP-PRRSV。

楊漢春等[11]在分析中國(guó)PRRSV流行毒株分子遺傳特征時(shí)發(fā)現(xiàn)，我國(guó)的PRRSV分離株與北美型毒株VR-2332較接近，病毒氨基酸同源性超過(guò)89%，而與歐洲型毒株氨基酸同源性低于60%，因此我國(guó)所流行的毒株為北美型毒株。最新的研究表明，HP-PRRSV起源于CH-1a等中國(guó)早前分離株，目前歐洲型和北美型毒株在我國(guó)都存在，但主要流行的是HP-PRRSV[9,11,16]。

本研究從送檢的血清中成功分離到2株P(guān)RRSV，并對(duì)這2株P(guān)RRSV進(jìn)行了基因測(cè)序分析，隨后的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)分離株處于北美分支，與HuN4的親緣關(guān)系最近，而基因序列與其他毒株同源性比較，發(fā)現(xiàn)其與HuN4的同源性最高，為99.5%，因此推斷這2株毒株最可能是在HuN4毒株的基礎(chǔ)上變異而來(lái)。雖然基因變化不大，但仍然有許多位點(diǎn)發(fā)生了核苷酸變化，如SDA2在3′UTR少了2個(gè)腺嘌呤核苷酸。SDA2和SDA3毒株的基因測(cè)序?yàn)镻RRSV的流行病學(xué)提供了新的參考序列，也為構(gòu)建HP-PRRSV毒株的感染性克隆奠定了基礎(chǔ)。

[1]Rossow K D.Porcine reproductive and respiratory syndrome [J].Vet Pathol,1998,35:1-20.

[2]Zimmerman J J,Yoon K J,Wills R W,et al.General overview of PRRSV:a perspective from the United States [J].Microbiol,1997,55:187-196.

[3]Keffaber.Reproductive failture of unknown etiology [J].Am Assoc Swine Pract News,1989,2:1-10.

[4]Terpstra C,Wensvoort G,Pol J M.Experimental reproduction of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (mystery swine disease) by infection with Lelystad virus:Koch’s postulates fulfilled [J].Vet Q,1991,13:131-136.

[5]Wensvoort G,Terpstra C,Pol J M A,et al.Mystery swine disease in the Netherlands:the isolation of Lelystad virus [J].Vet Q,1991,13:121-130.

[6]Collins J E,Benfield D A,Christianson W T,et al.Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs [J].J Vet Diagn Invest,1992,4:117-126.

[7]Allende R,Lewis T L,Lu Z,et al.North American and European Porcine reproductive and respiratory syndrome virus differ in non-structural protein coding regions [J].Gen Virol,1999,80:307-315.

[8]郭寶清，陳章永，劉文興，等．從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒中分離PRRSV的研究[J]．中國(guó)畜禽傳染病，1996，(2)：1-4．

[9]安同慶，田志軍，李 冉，等．我國(guó)高致病性豬藍(lán)耳病病毒的演化分析[J]．中國(guó)獸醫(yī)雜志，2011，47(4)：3-6．

[10]Tian K,Yu X,Zhao T,et al.Emergence of fatal PRRSV variants:unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark [J].PLOS ONE,2007,6:E526.

[11]Zhou L,Yang H C.Porcine reproductive and respiratory syndrome in China [J].Virus Research,2010,154:31-37.

[12]劉光清，云 濤，王根榮 等．豬生殖與呼吸綜合征病毒的基因組及致病的分子基礎(chǔ) [J]．病毒學(xué)報(bào)，2007，23(1)：79-83．

[13]Huang Y W,Meng X J.Novel strategies and approaches to develop the next generation of vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Virus Research,2010,154:141-149.

[14]Li Y,Wang X,Bo K,et al.Emergence of a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in the Mid-Eastren region of China[J].Vet J,2007,174:577-584.

[15]Zhou L,Zhang J,Zeng J,et al.The 30-amino-acid deletion in the NSP2 of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerging in China is not related to its virulence [J].J Virol,2009,83:5156-5157.

[16]Zhou L,Chen S X,Zhang J L,et al.Molecular variation analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China [J].Virus Res,2009,145:97-105.

2012-09-11

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(SKLVBP201202)。

張 楓(1987-)，男，湖北漢川人，碩士生，主要從事動(dòng)物基因工程疫苗的研究。

[作者簡(jiǎn)介]熊 濤，E-mail：xiongtao@hotmail.com；翁長(zhǎng)江，E-mail：wengchji@163.com。

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.11.006

S852.65+1;Q781

A

1673-1409(2012)11-S024-06