宋素貞 王洪波 (山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院職業(yè)病科,山東 濟(jì)南 25004)
Nrf2和IGF-1在胃黏膜癌變過程中的表達(dá)
宋素貞 王洪波1(山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院職業(yè)病科,山東 濟(jì)南 250014)
目的 研究核因子相關(guān)因子-2(Nrf2)及胰島素樣生長因子-1(IGF-1)在胃正常黏膜、增生性息肉、上皮內(nèi)腫瘤(GIN)及腺癌中的表達(dá)情況,并初步探討二者在胃癌癌變過程中的作用機(jī)制。方法 應(yīng)用免疫組化方法檢測Nrf2和IGF-1在胃正常黏膜、增生性息肉、各級(jí)GIN及不同分化程度腺癌中的表達(dá)情況。結(jié)果 Nrf2和IGF-1在正常胃黏膜中幾乎無表達(dá);從增生性息肉、GIN到腺癌,二者共表達(dá)逐漸增強(qiáng);在增生性息肉、GIN、腺癌中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),并且呈正相關(guān)(r=0.337,P=0.037)。結(jié)論 Nrf2和IGF-1表達(dá)增強(qiáng)可能與胃黏膜癌變過程有關(guān),二者表達(dá)水平升高有可能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。
核因子相關(guān)因子-2;胰島素樣生長因子-1;胃癌;致癌作用;氧化應(yīng)激
胃癌前病變?cè)谵D(zhuǎn)變?yōu)槲赴┑倪^程中,由于受到亞硝酸鹽、酒精、膽汁反流及幽門螺桿菌(HP)感染等外源性氧化應(yīng)激源的刺激,從而引起氧化應(yīng)激反應(yīng),致使機(jī)體組織細(xì)胞中產(chǎn)生過多活性氧自由基,導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷及突變,從而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。核因子相關(guān)因子-2(Nrf2)與機(jī)體的防御系統(tǒng)密切相關(guān),是細(xì)胞防御氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子,通過介導(dǎo)一系列抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達(dá),可以保護(hù)多種組織免受有害物質(zhì)的攻擊。因此,Nrf2已被列為腫瘤化學(xué)預(yù)防候選基因〔1,2〕。在既往研究中發(fā)現(xiàn)Nrf2基因敲除鼠惡性腫瘤的發(fā)病率明顯高于野生鼠。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)有顯著的抗凋亡作用,對(duì)腫瘤細(xì)胞的耐藥性起關(guān)鍵作用〔3,4〕。本研究擬探討Nrf2及IGF-1在胃癌癌變過程中的作用機(jī)制。
1.1 材料 本研究中283例病人胃組織標(biāo)本來源于山東大學(xué)第二醫(yī)院。其中,腺癌135例,來自2001~2005年病理科手術(shù)切除標(biāo)本;上皮內(nèi)腫瘤(GIN)96例(62例低級(jí)別以及34例高級(jí)別,包括6例原位癌)、增生性息肉30例及正常胃黏膜組織22例,均來自2005~2008年胃鏡室活檢標(biāo)本。臨床及病理信息包括姓名、性別、年齡、腫瘤浸潤深度、組織類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等均來自臨床資料。Nrf2、IGF-1表達(dá)及共表達(dá)情況分低、中、高三組。所有病理科診斷均參照WHO胃癌病理學(xué)及遺傳學(xué)分類,由三名病理科醫(yī)師共同診斷。所有患者材料均經(jīng)家屬同意,并有知情同意書。獲道德及倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法 標(biāo)本經(jīng)甲醛固定,常規(guī)程序化脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片(4 μm)后,進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色和免疫組化染色。Nrf2應(yīng)用兔抗人 Nrf2多克隆抗體(Abcam公司;ab53019,稀釋度1∶500)進(jìn)行檢測。IGF-1應(yīng)用鼠抗人IGF-1單克隆抗體 (Santa Cruz公司;sc-74116,稀釋度1∶400)進(jìn)行檢測。切片脫蠟,3%過氧化氫溶液孵育10 min除去內(nèi)源性過氧化物酶。后進(jìn)行抗原恢復(fù)步驟。切片應(yīng)用0.01 mol/L檸檬酸緩沖液(pH6.0)浸泡,微波爐加熱25 min。0.01 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;pH7.4)沖洗,常溫下濕盒內(nèi)正常血清覆蓋切片30 min。0.01 mol/L PBS沖洗掉多余血清,常溫下濕盒內(nèi)應(yīng)用一抗孵育45 min。然后,PBS沖洗,37℃下濕盒內(nèi)應(yīng)用生物酰化的二抗孵育40 min,PBS沖洗,加入鏈親和素-過氧化物酶復(fù)合物(DAKO),切片在室溫下孵育45 min,0.01 mol/L PBS沖洗,顯微鏡下3,3'二氨基聯(lián)苯胺4-鹽酸溶液(DAB)覆蓋15 min(顯色),流動(dòng)的自來水浸泡,HE復(fù)染1 min,自來水浴,一系列漸高濃度酒精浸泡,而后二甲苯浸泡,封蓋玻片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。
1.3 結(jié)果判斷 細(xì)胞染色陽性信號(hào)為棕黃色顆粒,定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。組織學(xué)及免疫組化染色評(píng)價(jià)由3位病理學(xué)家獨(dú)立完成。有爭議的切片重新評(píng)估以達(dá)成共識(shí)。每份樣本,至少3 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色評(píng)估。切片放大200倍觀察,測定胞質(zhì)染色的原發(fā)性癌細(xì)胞百分比。另外,根據(jù)腫瘤細(xì)胞染色的百分?jǐn)?shù),分為“低表達(dá)”(<33%癌細(xì)胞染色)、“中表達(dá)”(≥33%并且<66%癌細(xì)胞染色)及“高表達(dá)”(≥66% 癌細(xì)胞染色)〔5〕。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,采用方差齊性檢驗(yàn),兩組間比較應(yīng)用Pearson相關(guān)分析及Mann-Whitney檢驗(yàn)。
2.1 Nrf2因子及IGF-1在非腫瘤性病變中的表達(dá) Nrf2在正常胃黏膜幾乎無表達(dá),良性增生性病變中低表達(dá);陽性表達(dá)多位于細(xì)胞質(zhì),部分位于細(xì)胞核;30例增生性息肉中,16例無表達(dá),14例合并嚴(yán)重炎癥者呈低表達(dá)。與Nrf2表達(dá)情況類似,IGF-1在正常胃黏膜組織中無表達(dá);在增生性息肉中,2例中度表達(dá),13例低表達(dá),15例無表達(dá)。Nrf2及IGF-1在系列切片中,2例呈現(xiàn)共表達(dá)。見圖1。
圖1 增生性息肉Nrf2和IGF-1表達(dá)
2.2 Nrf2因子及IGF-1在GIN中表達(dá) Nrf2在癌前病變中表達(dá)增強(qiáng)。Nrf2在62例低級(jí)別GIN中,13例高表達(dá),25例中等表達(dá),24例低表達(dá)(包括4例陰性);34例高級(jí)別GIN者,15例高表達(dá),15例中表達(dá),4例低表達(dá)(包括2例陰性);Nrf2在高級(jí)別及低級(jí)別GIN中表達(dá)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034)。IGF-1在GIN中表達(dá)上調(diào),62例低級(jí)別GIN中,18例高表達(dá),15例中等表達(dá),29例低表達(dá)(包括4例陰性);34例高級(jí)別GIN者,7例高表達(dá),6例中表達(dá),21例低表達(dá)(包括13例陰性表達(dá));IGF1在高級(jí)別及低級(jí)別GIN中表達(dá)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.058)。Nrf2及IGF-1共表達(dá),在GIN中表達(dá)水平較增生性息肉提高,而高、低級(jí)別GIN中高、中、低共表達(dá)分別為7、6、4例及12、21、12例,組間無明顯差別(P=0.062)。見圖2。
2.3 Nfr2及IGF-1在腺癌中的表達(dá) 在135例腺癌中,Nrf2、IGF-1表達(dá)均增強(qiáng),Nrf2及IGF-1共表達(dá)亦增強(qiáng),見圖3。Nfr2、IGF-1以及共表達(dá)情況在增生性息肉、GIN及腺癌中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。此外,良性病變、癌前病變及惡性病變中,Nfr2及 IGF-1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.337,P=0.037)。Nrf2、IGF-1及二者共表達(dá)與腫瘤分類、侵犯深度及轉(zhuǎn)移有關(guān)。見表1。
圖2 上皮內(nèi)腫瘤Nrf2和IGF-1表達(dá)(×200)
圖3 腺癌Nrf2和IGF-1表達(dá)(×200)
表1 Nrf2及IGF-1表達(dá)與胃腺癌浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系(n)
癌變過程是環(huán)境和遺傳因素相互作用而引起多基因突變和其他生物大分子改變積累的結(jié)果,是涉及啟動(dòng)、促進(jìn)和進(jìn)展等多階段的復(fù)雜過程。化學(xué)致癌物經(jīng)肝臟I相代謝酶(如細(xì)胞色素P450)催化后形成親電子活性致癌物,與DNA及蛋白質(zhì)結(jié)合形成加成物,引起癌基因和抑癌基因改變;而經(jīng)Ⅱ相代謝酶,如谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(GST)的生物轉(zhuǎn)化作用,使終致癌物親水性增強(qiáng),促進(jìn)其體外排泄。Nrf2是調(diào)節(jié)Ⅱ相代謝酶表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子,通過與靶基因的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合,調(diào)節(jié)多種解毒酶的表達(dá)。Nrf2的激動(dòng)劑CDDO-Im可以預(yù)防黃曲霉素介導(dǎo)的肝細(xì)胞癌前病變的發(fā)生〔6,7〕。抑制Nrf2向細(xì)胞核易位會(huì)加重氧化應(yīng)激,導(dǎo)致非諾貝特介導(dǎo)的肝癌的形成〔8〕。Nrf2缺陷鼠比野生鼠更易形成肺轉(zhuǎn)移癌結(jié)節(jié)〔9〕。
氧化應(yīng)激破壞了機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化的平衡,致使組織細(xì)胞中自由基產(chǎn)生增多,從而導(dǎo)致了包括腫瘤在內(nèi)的一些疾病的發(fā)生。生理狀態(tài)下,Nrf2與胞漿蛋白伴侶分子Keap1(Nrf2的Cullin3型泛素連接酶)耦連,錨合于胞質(zhì),處于活性相對(duì)抑制狀態(tài)。親電子脂質(zhì)過氧化物4-羥基-2-壬烯醛(HNE)通過修飾Keap1,使其構(gòu)象發(fā)生改變,使Nrf2解離后轉(zhuǎn)入胞核〔10〕。在癌癥化學(xué)預(yù)防研究中,叔丁基對(duì)苯二酚(tBHQ)及萊菔硫烷(SFN)誘導(dǎo)Nrf2在結(jié)直腸癌細(xì)胞胞核內(nèi)積聚,激活Nrf2依賴的ARE介導(dǎo)的基因表達(dá)〔11〕。P62可與Keap1的Nrf2結(jié)合位點(diǎn)相互作用,P62過表達(dá)或自我吞噬缺陷與Nrf2和Keap1的交互作用競爭,最終導(dǎo)致Nrf2穩(wěn)定及其靶基因轉(zhuǎn)錄活化〔12〕。近期一項(xiàng)研究表明,1 145例癌組織應(yīng)用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP),其中22例鱗癌中有21例檢測到Nrf2基因突變(突變率99.5%)。所有發(fā)現(xiàn)Nrf2突變的食管鱗癌及皮膚鱗癌中,細(xì)胞核中的Nrf2表達(dá)均增強(qiáng)。然而,所有鱗癌中未發(fā)現(xiàn)Keap1突變。以上提示Nrf2突變?cè)邝[癌發(fā)展中具有至關(guān)重要的作用,這是鱗癌的特點(diǎn)〔13〕。在人類的結(jié)腸癌細(xì)胞中,一氧化氮促進(jìn)Nrf2在胞核中快速積聚,對(duì)照組細(xì)胞中的Nrf2則在胞質(zhì)中表達(dá)。Nrf2在胞核中積聚與轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)和轉(zhuǎn)錄后修飾有關(guān)〔14〕。IGF-1是有絲分裂潛在刺激物,能促進(jìn)細(xì)胞分化及轉(zhuǎn)化。此外,IGF-1是主要的生存因子,可以保護(hù)細(xì)胞免于各種環(huán)境下的凋亡。
本研究證實(shí),Nrf2和IGF-1在胃黏膜癌前病變及腺癌中表達(dá)較良性增生性病變明顯升高,與此結(jié)果一致的是,二者共表達(dá)水平在胃黏膜癌前病變及腺癌中亦升高。提示二者與癌變過程甚至與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)。在正常及良性病變,二者共表達(dá)為無或低水平,但在癌前病變及腺癌中共表達(dá)上調(diào)。這一結(jié)果揭示二者之間存在協(xié)同效應(yīng),這種協(xié)同可能導(dǎo)致癌變發(fā)生,甚至促進(jìn)腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移。Nrf2表達(dá)水平在高、低級(jí)別GIN差異顯著,提示高級(jí)別GIN可能接受了更多的氧化損傷,導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷及突變,即Nrf2基因的突變。有研究報(bào)導(dǎo)Nrf2為一種核蛋白〔15〕,本研究結(jié)果表明其在癌前病變及腺癌細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),顯示胞質(zhì)Nrf2可能為突變后過表達(dá)并有促進(jìn)癌變發(fā)生的作用。另外,IGF-1表達(dá)從良性病變至惡性病變?cè)黾樱崾酒溆斜Wo(hù)癌細(xì)胞抗凋亡及促進(jìn)腫瘤進(jìn)展作用。國外研究已證實(shí),IGF-1陽性結(jié)直腸癌較陰性者有更高的進(jìn)展率,且有較高妥昔單抗(表皮生長因子單抗)耐藥率,生存期亦縮短〔4〕。本研究資料顯示低分化腺癌較高分化者有更高的Nrf2和IGF-1陽性表達(dá)率。Nrf2和IGF-1共表達(dá)暗示其在胃癌發(fā)生進(jìn)展方面具有協(xié)同作用,可能對(duì)預(yù)后預(yù)測有一定價(jià)值。
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R735.2
A
1005-9202(2012)17-3658-04;
10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.018
1 山東大學(xué)第二醫(yī)院消化科
王洪波(1974-),男,博士,主治醫(yī)師,主要從事消化道腫瘤基礎(chǔ)及臨床研究。
宋素貞(1977-),女,碩士,講師,主要從事消化道腫瘤基礎(chǔ)及臨床研究。
〔2012-01-07收稿 2012-03-04修回〕
(編輯 袁左鳴)