延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院局解手術(shù)學(xué)教研室（延安716000） 朱文俠 王航輝 韓振奎

腸缺血再灌注損傷（Intestinal ischemia reperfusion injury，IIRI）是常見的臨床圍手術(shù)期難題。IIRI可引起伴通透性增加的腸上皮屏障功能障礙與細(xì)菌易位。另外，腸被認(rèn)為是炎性細(xì)胞因子引起腸源性全身炎癥反應(yīng)綜合征、敗血癥、多器官功能衰竭進(jìn)展的根源［1，2］，因此保護(hù)腸粘膜屏障日益受到重視。腸缺血再灌注損傷后，缺氧、內(nèi)毒素、酸中毒等多種因素影響腸粘膜屏障（Intestinal mucosal barrier）的結(jié)構(gòu)和功能。β-七葉皂甙鈉（Sodium aescinate，SA）為純天然植物提取物，是從中藥娑羅子的干燥成熟果實中提取的二萜皂甙鈉鹽，最大限度地保存了生物活性。研究證明［3～7］：β-七葉皂甙鈉具有抑制炎癥、清除自由基、抗?jié)B出、抗水腫、抗凋亡，改善微循環(huán)等作用。本研究旨在探索β-七葉皂甙鈉對大鼠腸缺血再灌注損傷早期腸粘膜屏障功能和形態(tài)學(xué)研究，進(jìn)一步探討其保護(hù)腸粘膜屏障的作用及可能機(jī)制。

材料和方法

1 實驗動物及分組 成年雄性SD大鼠54只，體重為170～180g，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組和模型組、β-七葉皂甙鈉（山東煙臺綠葉制藥股份有限公司）治療組。

2 方 法

2.1 制作大鼠腸缺血-再灌注損傷模型：麻醉大鼠，作腹正中切口，分離出腸系膜上動脈（Superior mesenteric artery，SMA）。假手術(shù)組只分離SMA，不結(jié)扎；模型組在SMA根部用無創(chuàng)傷血管夾夾閉，阻斷45min后松夾，恢復(fù)血流后觀察24h；治療組同前，于缺血前30min對每只大鼠行尾靜脈推注β-七葉皂甙鈉（10mg／kg）。假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水。再灌注24h后處死動物，取回盲部10cm以上腸管，固定，包埋，4℃保存。一部分測濕／干重比值；一部分光學(xué)顯微鏡觀察小腸組織的損傷程度。手術(shù)過程中，腹腔內(nèi)滴加生理鹽水5ml。

2.2 腸組織濕／干比值的測定：取小腸組織，吸干表面水分后稱重量為濕重（W）；然后將組織置入70℃恒溫電烤箱中反復(fù)烘烤72h至恒重，稱重量為干重（D）。計算濕重與干重比值（W／D），表示組織水腫形成情況，間接反映毛細(xì)血管的通透性。

2.3 腸組織血管通透性檢測：根據(jù)滲入組織中的伊文氏藍(lán)染料量評價血管的通過性［8］。再灌注前2 min，于股靜脈注射2%伊文思藍(lán)（Evans Blue，EB）2 mg／kg，再灌結(jié)束后取回盲部10cm以上腸管約5cm剪開，37℃干燥24h，稱重后用3ml甲酰胺室溫浸泡24h提取伊文氏藍(lán)。620nm處繪制伊文氏藍(lán)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以μg／g腸組織表示。

2.4 透射電鏡觀察腸粘膜屏障變化：再灌注24 h后取腸組織，將回腸標(biāo)本修成1mm×1mm×3 mm大小，固定，脫水、浸透、包埋、超薄切片，透射電鏡觀察（TOSHI-BA，Japan）。

結(jié) 果

1 腸粘膜結(jié)構(gòu)的Chiu’s評分［9］評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。光鏡下假手術(shù)組腸粘膜形態(tài)結(jié)構(gòu)完整（圖1）；模型組腸粘膜和粘膜下層充血、水腫、糜爛，中性粒細(xì)胞浸潤（圖2）；治療組亦可見上述表現(xiàn)，但損傷程度較模型組明顯減輕（P＜0.05）（圖3）。Chiu’s評分模型組的最高、假手術(shù)組最低。治療組相對模型組明顯降低（P＜0.05）（見表2）。

表1 腸粘膜損傷評分分級

表2 大鼠腸組織Chiu評分、濕／干重比值及伊文思藍(lán)含量（n＝6，±s）

表2 大鼠腸組織Chiu評分、濕／干重比值及伊文思藍(lán)含量（n＝6，±s）

注：模型組和β-七葉皂甙鈉治療組比較＊P＜0.05，假手術(shù)組和β-七葉皂甙鈉治療組比較＊＊P＜0.05

分組 Chiu’s評分 濕／干重比值（%）伊文思藍(lán)含量（μg／g）4.89±0.61 103.39±10.27模型組 4.0±0.35＊＊ 6.46±0.27＊ 285.46±21.09＊β-七葉皂甙鈉治療組 2.3±0.26 5.19±0.51＊ 140.25±19.18假手術(shù)組 0±0.000＊＊

2 各組大鼠腸濕／干重比值 如表2所示。β-七葉皂甙鈉能明顯降低腸缺血再灌注大鼠的腸濕／干重比值，與模型組比較差異顯著（P＜0.05）。

3 β-七葉皂甙鈉對大鼠腸粘膜屏障通透性的影響 腸缺血再灌注后，模型組及β-七葉皂甙鈉組腸組織EB含量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）；而β-七葉皂甙鈉組腸組織EB含量較模型組明顯降低（P＜0.05），提示β-七葉皂甙鈉對腸粘膜屏障有較好的保護(hù)作用（表2）。

4 β-七葉皂甙鈉對腸粘膜組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 假手術(shù)組腸粘膜形態(tài)完整，緊密連接和橋粒結(jié)構(gòu)清晰，可見大量排列整齊的微絨毛（圖1）。模型組腸粘膜結(jié)構(gòu)紊亂，絨毛破損，緊密連接結(jié)構(gòu)模糊、腫脹，微絨毛大量脫落、斷裂（圖2）；而β-七葉皂甙鈉組腸粘膜破壞減輕，緊密連接結(jié)構(gòu)大致可見，腫脹緩解（圖3）。

圖1 假手術(shù)組大鼠正常腸粘膜結(jié)構(gòu)（H＆E×200）

圖2 模型組大鼠腸粘膜結(jié)構(gòu)破壞（H＆E×200）

圖3 治療組大鼠腸粘膜結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)（H＆E×200）

討 論

腸粘膜屏障是腸道防御機(jī)制中最重要的環(huán)節(jié)，主要由機(jī)械屏障、生物屏障、免疫屏障［10，11］及化學(xué)屏障構(gòu)成，其中機(jī)械屏障是腸粘膜屏障的根本。腸道機(jī)械屏障由腸粘膜表面的粘液層、腸上皮層及其密連接、上皮基底膜、粘膜下固有層等組成。廣義的機(jī)械屏障還包括腸道的運(yùn)動功能，腸蠕動將腸內(nèi)食物殘渣向遠(yuǎn)側(cè)推進(jìn)，防止細(xì)菌在鄰近腸粘膜的長時間滯留，減少細(xì)菌穿過粘液層到達(dá)上皮的機(jī)會，起“腸道自潔作用”。機(jī)械屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是腸粘膜上皮細(xì)胞細(xì)胞與細(xì)胞之間完整的連接。腸缺血再灌注等應(yīng)激狀態(tài)下，其結(jié)構(gòu)完整性和連續(xù)性被破壞，致使機(jī)械屏障作用減弱［12］。本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠腸粘膜的光鏡、電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，腸粘膜組織結(jié)構(gòu)紊亂、破壞。治療組大鼠使用中藥β-七葉皂甙鈉后，光鏡下組織病理、電鏡下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察顯示腸粘膜組織結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，表明其對腸粘膜屏障組織結(jié)構(gòu)有較好的保護(hù)作用。

圖4 假手術(shù)組大鼠正常腸粘膜上皮細(xì)胞（TEM×6600）

圖5 模型組大鼠腸粘膜上皮細(xì)胞凋亡（TEM×8900）

圖6 β-七葉皂甙鈉組大鼠腸粘膜結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)（TEM×8900）

腸道最主要功能是吸收營養(yǎng)、排出食物殘渣、細(xì)菌及其產(chǎn)物。這些功能的維持有賴于腸粘膜的連續(xù)性與屏障結(jié)構(gòu)的完整性。然而，在特定的病理狀態(tài)下，如腸缺血再灌注損傷，腸失去其屏障功能可導(dǎo)致全身性微生物感染甚至多器官功能衰竭［13，14］。實驗發(fā)現(xiàn)，腸缺血再灌注24h后，滲漏到血管外的EB含量和腸組織濕／干重較假手術(shù)組明顯增加，與電鏡觀察到毛細(xì)血管周圍有大片水腫，共同提示腸粘膜屏障的通透性顯著增加，引起了血管源性腸水腫。此過程中腸機(jī)械屏障開放可能與腸組織的過度灌流、自由基形成有關(guān)。腸粘膜結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致其屏障功能減弱，通透性增加。使生理狀態(tài)下不能通透的物質(zhì)進(jìn)入組織間隙，繼發(fā)血管源性腸水腫，進(jìn)一步加重再灌注損傷。β-七葉皂甙鈉能攜帶長鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體參加β氧化，并且作為氧自由基抑制劑，能減輕氧化應(yīng)激、減少脂質(zhì)過氧化、抗凋亡［5，13］。應(yīng)用β-七葉皂甙鈉后，腸組織 EB含量和腸組織濕／干重減少，毛細(xì)血管周圍的水腫也減輕，提示β-七葉皂甙鈉在代謝紊亂時對腸的正常功能的維持起著重要的保護(hù)作用。

綜上所述，β-七葉皂甙鈉可以維護(hù)腸粘膜屏障的完整性和連續(xù)性，降低腸粘膜血管的通透性，進(jìn)一步證實了β-七葉皂甙鈉對腸缺血再灌注損傷所致腸粘膜屏障的形態(tài)與功能具有保護(hù)作用，為其在腸粘膜屏障損傷中的防治提供了理論依據(jù)。β-七葉皂甙鈉對腸粘膜屏障保護(hù)作用的詳細(xì)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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