闞玉玲，管洪在

（青島大學醫(yī)學院血液學教研室，山東 青島 266021）

黏著斑激酶（FAK）屬于細胞漿內(nèi)非受體蛋白酪氨酸激酶（NRPTKs），位于細胞和細胞外基質(zhì)結(jié)合部位整合素構(gòu)成的灶性黏附復合體上。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK不僅在正常細胞的生長周期、增殖分化、遷移運動及血管生成等過程中發(fā)揮重要作用，而且在多種腫瘤細胞中高表達，在腫瘤細胞激活及侵襲轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用，已逐漸成為目前腫瘤治療的新靶點［1－2］。越來越多的證據(jù)顯示，F(xiàn)AK基因的過表達及FAK的激活與許多人類實體腫瘤及血液惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3］。本研究通過檢測急性白血?。ˋL）病人白血病細胞FAK基因表達，旨在探討其與AL發(fā)生、發(fā)展及預后的關(guān)系。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2010年8—12月在青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院就診的AL病人50例，男22例，女28例；年齡10～82歲，中位年齡48歲。其中急性非淋巴細胞白血病（ANLL）36例（M1型1例，M2型16例，M3型10例，M4型5例，M5型4例），急性淋巴細胞白血?。ˋLL）14例（L1型6例，L2型8例）。初診病人30例，復發(fā)7例，緩解13例，其中復發(fā)和緩解病人均非該初診病人轉(zhuǎn)化而來。誘導緩解化療方案：初治ALL選用VDCP或VDLP方案；初治急性髓樣白血?。ˋML）選用DA或MA方案；M3病人采用全反式維甲酸（ATRA）或三氧化二砷（As2O3）治療，如白細胞增高加小劑量HA或標準劑量DA。以上病人的診斷及療效標準均參照張之南等［4］主編的《血液病診斷及療效標準》。選擇10例健康人作為正常對照組，男5例，女5例；年齡18～57歲，中位年齡43歲。

1.2 基因提取及擴增方法

1.2.1 單個核細胞（MNC）的分離 在無菌條件下采集骨髓液2 mL，EDTA抗凝，用Ficoii淋巴細胞分離液（相對密度1.077）分離MNC，用1×PBS洗滌2～3次。－80℃凍存?zhèn)溆没蛑苯犹崛NA。

1.2.2 總RNA的提取 用原平皓（天津）生物技術(shù)有限公司提供的RNApure超純總RNA離心柱式試劑盒提取RNA。經(jīng)紫外線分光光度計測定RNA純度（A260／A280＞1.6），同時進行 RNA 定量測定。在15 g／L瓊脂糖凝膠上電泳可見3條清晰亮帶，說明所提取RNA完整。

1.2.3 c DNA合成 應用M－MVL逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fer mentas公司）合成c DNA。逆轉(zhuǎn)錄反應體系20 mL，包括總 RNA 1μg，0.5 g／L的 OLigo（d T）pri mer 1μL，使用DEPC水補充至12μL?？焖偎矔r離心，置65℃孵育5 min，立即置于冰上；然后依次加入55×緩沖液4μL，RNase抑制劑1μL，10 mmo L／L d NTP Mix 2μL，混勻，42℃2 min；再加入逆轉(zhuǎn)錄酶（M－MLV）1μL，42℃反應30 min，70℃下放置10 min，冰上5 min。

1.2.4 PCR反應 PCR反應體系包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4μL，20μmol／L的FAK正、反義鏈引物各1μL，2×PCR Mix10μL（其中包括10mmol／L 的d NTPs、10×緩沖液、Taq DNA 聚合酶），其余以DEPC水補足至20μL。所用引物根據(jù)Gen Bank提供的FAK mRNA序列，由上海生工公司設(shè)計合成。FAK正義鏈為5′－TATTGGACCTGCGAGGGATTGG－3′，反義鏈為5′－GAGGCGGTTTCTTTGGTGGAGC－3′，目的基因長度為255 bp。β－actin正義鏈為 5′－AAACACCCCAGCCATGTACGT－3′反義鏈為5′－GTGGTGGTGAAGCTGTAGC－3′，目的基因長度為228 bp。內(nèi)參照與目的基因分別擴增，PCR條件：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，60℃ 退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)；72℃ 再延伸5 min。

1.2.5 PCR產(chǎn)物分析 取PCR產(chǎn)物10μL與Loading Buffer 2μL混合，在15 g／L瓊脂糖凝膠中電泳，80 V恒壓電泳25 min，EB染色［5］。陽性結(jié)果可見228、255 bp處各有一條亮帶，分別為β－actin和FAK。紫外線透射儀觀察并照相，照片經(jīng)Metamor ph I maging Sight軟件進行分析并讀取吸光度值，取FAK與β－actin曲線下面積的比值作為FAK mRNA的相對含量。

1.3 染色體的制備及R顯帶和核型分析

1.3.1 染色體的制備 將白血病病人骨髓細胞按（1～2）×109／L的密度接種于 RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，加入0.05 mg／L秋水酰胺，37℃ 孵育1 h。1000 r／min離心10 min，棄上清液，加入預溫至37℃的0.075 mol／L KCl溶液8 mL，37℃孵育30 min進行低滲。加入1 mL固定液（甲酸∶乙醇＝3∶1）輕輕混勻進行預固定，離心后再進行3次固定，將最后一次固定的標本以1 000 r／min離心10 min，棄上清液，加入適量固定液配成細胞懸液，備用［6］。

1.3.2 染色體R顯帶 采用氣干法制片，將制備好的片子晾干，放入R顯帶液中，87.5℃水浴70～80 min。取出片子水洗，晾干，再加Giemsa液染色15 min，水洗，干后鏡檢。

1.3.3 染色體核型分析 每例病人分析10～20個分裂中期細胞，觀察有無染色體異常。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學處理，兩組率比較用χ2檢驗和精確概率檢驗；計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 FAK mRNA在AL病人骨髓MNC中的表達

AL病人FAK mRNA陽性表達率為66.0%，與正常對照組（20.0%）比較差異有顯著意義（χ2＝5.49，P＜0.05）。其中ALL和ANLL病人陽性表達率分別為71.4%和63.9%，二者差異無顯著意義（P＞0.05），但兩者均高于正常對照組（P＝0.04；χ2＝4.44，P＜0.05）。ALL和 ANLL病人 FAK mRNA的表達水平分別為0.75±0.12和0.65±0.17，二者差異無顯著性（P＞0.05），但與正常對照組（0.31±0.15）比較，差異有顯著意義（t＝7.98、5.60，P＜0.05）。部分病人電泳結(jié)果見圖1。

圖1 部分病人FAK mRNA電泳結(jié)果

2.2 FAK mRNA在不同時期AL病人的表達

初診組和復發(fā)組AL病人白血病細胞FAK mRNA的陽性表達率分別為80.0%、85.7%，兩組比較差異無顯著性（P＞0.05），但均高于正常對照組（χ2＝9.38，P＜0.05；P＝0.02）。初診組和復發(fā)組AL病人白血病細胞FAK mRNA表達水平分別為0.72±0.12、0.87±0.15，兩組比較差異無顯著意義（P＞0.05），但均高于正常對照組（t＝8.79、7.58，P＜0.05）。緩解組病人FAK mRNA的陽性表達率為23.1%，均明顯低于初診組和復發(fā)組，差異均有顯著意義（χ2＝10.26，P＜0.05；P＝0.02）；與正常對照組比較差異無顯著性（P＞0.05）。緩解組病人FAK mRNA表達水平為0.27±0.17，明顯低于初診組和復發(fā)組（t＝4.44、7.82，P＜0.05），與正常對照組比較差異無顯著性（P＞0.05）。

2.3 FAK mRNA的表達與骨髓細胞染色體核型的關(guān)系

AL病人骨髓細胞染色體異常核型的檢出率為64.0%（32／50）。FAK mRNA 在異常核型組的陽性表達率為78.1%，明顯高于異常核型未檢出組的44.4%（χ2＝5.82，P＜0.05）；FAK mRNA 在異常核型組的表達水平為0.75±1.17，明顯高于異常核型未檢出組的0.45±0.11（t＝6.72，P＜0.05）。

3 討 論

FAK是SCHALLER等［7］于1992年發(fā)現(xiàn)的能使Src內(nèi)源性蛋白酪氨酸激酶激活的主要底物，在絲氨酸轉(zhuǎn)化細胞的磷酸化蛋白中發(fā)現(xiàn)。FAK廣泛分布于成纖維細胞、血小板、表皮細胞、內(nèi)皮細胞、TC、BC、中性粒細胞、單核細胞和滋養(yǎng)層細胞等的細胞質(zhì)中。已知FAK有6個可以被磷酸化的酪氨酸位點，F(xiàn)AK主要通過這些位點的磷酸化并與含有SH2或SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相結(jié)合，通過整合素、FAK／Src／Pl30CAS／JNK、FAK／PI3激酶以及FAKROCK／Rho A等多條信號通路參與細胞多種生物學過程，并參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移［3］。

白血病是遺傳學和表型上異質(zhì)性疾病，為多種癌基因、抑癌基因結(jié)構(gòu)或表達異常及細胞信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)失衡等協(xié)同作用的結(jié)果。迄今，有關(guān)FAK與白血病相關(guān)性研究報道較少。2004年RECHER等［8］報道，在AML中發(fā)現(xiàn)有FAK蛋白的高表達和過度激活，并提示FAK的高表達與白血病細胞的遷移、預后及耐藥性有關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，AL病人FAK基因的表達率、表達水平均明顯升高，其升高的具體機制不是十分清楚。先前有研究結(jié)果表明，F(xiàn)AK的磷酸化受到整合素、細胞因子、致癌基因和酪氨酸激酶受體的調(diào)節(jié)［9］。異常整合素或細胞因子的信號通路以及Ras等致癌基因產(chǎn)物的表達均可以導致AML細胞中FAK的磷酸化，從而進一步導致下游一系列信號通路的持續(xù)激活。另外有研究結(jié)果顯示，在A ML細胞中20%的病人有8q22－8q24染色體區(qū)域擴增，而這個區(qū)域正是FAK基因所在，因此，8q的擴增可能與FAK在ANLL細胞異常表達有關(guān)系。FAK與血液系統(tǒng)中B細胞成熟過程也有關(guān)系，LE等［10］研究顯示，F(xiàn)AK是CXCL12－CXCR4軸的下游信號分子，并介導細胞的黏附作用。CXCL12誘導未成熟B細胞FAK蛋白磷酸化，通過PKC等信號共同調(diào)控細胞的成熟與運動。有關(guān)FAK基因在ALL表達增高的具體機制仍需進一步探討。

本研究結(jié)果還顯示，初診組和復發(fā)組病人白血病細胞FAK基因的表達率和表達水平較正常對照組明顯升高，而緩解組則明顯降低，推測FAK基因表達與白血病的病情進展有關(guān)，是預后不良的因素之一。TARDY等［11］最近研究顯示，A ML病人白血病細胞中FAK蛋白高表達則其預后相對較差。本文結(jié)果與TARDY等［11］的研究結(jié)果一致，說明FAK是影響白血病病人生存率的重要因素之一。

LE等［12］采用 BCR－ABL－Ba F3細胞系 （一種BCR－ABL基因轉(zhuǎn)染的前B淋巴細胞）研究顯示，F(xiàn)AK基因沉默技術(shù)使細胞的增殖和克隆形成均減少，中位生存期延長，且伊馬替尼對BCR－ABL細胞的療效增加。這表明FAK對ALL的進展具有一定的促進作用。FAK的高表達抑制腫瘤細胞失去細胞黏附后的失巢凋亡，導致癌細胞以非錨定生長方式不斷增殖，這有助于腫瘤細胞的存活和侵襲轉(zhuǎn)移。FAK的高表達可能是造成白血病細胞耐藥的又一重要因素。

不同種類的白血病常有各自的特征性染色體異常，因此染色體檢查有助于白血病的診斷和預后判定。本研究顯示，異常核型檢出組FAK mRNA的陽性表達率及表達水平明顯高于未檢出組，表明該基因的表達與染色體的改變具有內(nèi)在聯(lián)系。磷酸化FAK表達上調(diào)在細胞基因突變中起著重要作用，它能夠上調(diào)細胞增殖、擾亂細胞間的接觸抑制、抗凋亡、促進細胞的侵襲以及血管生成等。染色體異常病人FAK mRNA表達增高可能是由于基因插入、缺失等原因激活了該基因的表達，但是具體機制還需進一步的研究。

許呂宏等［13］成功構(gòu)建FAK sh RNA慢病毒載體，發(fā)現(xiàn)基因沉默技術(shù)可誘導白血病細胞凋亡。提示抑制該基因會在源頭上阻止白血病的發(fā)生。另外，選擇FAK抑制劑FIP200等或選擇性抑制FAK的催化活性均可抑制FAK的功能，從而阻斷多條與腫瘤相關(guān)的信號通路。這可能是更加接近針對白血病本質(zhì)的治療策略，F(xiàn)AK可能是白血病治療的一個新靶點。

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