裴小娟 楊清緒 鄒冬梅 朱影玲

1.廣東省惠州市中心人民醫(yī)院病理科，廣東惠州 516001；2.中華醫(yī)學會惠州東江病理學會病理診斷中心，廣東惠州 516001

惠州客家人群食管癌EGFR蛋白表達及與MAPK信號通路相關性的初步研究

裴小娟1楊清緒1鄒冬梅2朱影玲1

1.廣東省惠州市中心人民醫(yī)院病理科，廣東惠州 516001；2.中華醫(yī)學會惠州東江病理學會病理診斷中心，廣東惠州 516001

目的 檢測EGFR在惠州客家人群食管癌組織的表達，探討EGFR與惠州客家人群食管癌發(fā)生發(fā)展之間的關系及與MAPK信號傳導激活狀態(tài)的相關性。方法采用免疫組織化學及免疫蛋白印跡方法，檢測53例惠州客家人群食管癌和癌旁正常組織標本中EGFR、MAPK（ERK1/2）和p-ERK1/2蛋白的表達。結果EGFR和p-ERK1/2在食管癌組織中的表達率顯著高于癌旁正常組織（P<0.01）；分化程度越低，EGFR和p-ERK1/2的表達越高；有淋巴結轉移患者EGFR和p-ERK1/2的表達明顯高于無淋巴轉移者（P<0.01）；浸潤淺肌層患者的p-ERK1/2表達陽性率明顯低于浸潤深肌層（P<0.05）。結論EGFR/MAPK信號傳導與惠州客家人群食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。伴隨EGFR的過表達，MAPK（ERK1/2）信號通路活化水平升高，EGFR/MAPK信號通路可為食管癌的早期基因治療提供新的靶點。

食管癌；惠州客家人群；EGFR蛋白；MAPK蛋白；信號傳導

研究表明，食管癌發(fā)病表現(xiàn)為一定的地域分布。河南林州市，廣東省潮汕地區(qū)和梅州地區(qū)（客家人為主）為食管癌高發(fā)區(qū)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，惠州地區(qū)客家人群食管癌與PTEN/STAT1/3信號傳導密切相關[1]，但信號傳導通路極為復雜，是否EGFR/MAPK信號傳導在惠州客家人群食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，需要進一步探討。表皮生長因子受體EGFR（epidermal growth factor receptor）屬于細胞表面酪氨酸激酶受體erbB家族成員，在多種腫瘤如食管癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌、子宮內膜癌中表達或高表達，并且EGFR高表達是腫瘤患者預后差的一個重要指標[2]。研究表明，EGFR配體有 TGF-α、EGF、Epiregulin、β-cellulin 等，配體與 EGFR 結合引起erbB家族成員內部同二聚體或異二聚體受體復合物形成，胞質區(qū)便自我磷酸化，啟動相應的信號傳導通路。受體復合物自我磷酸化可以激活幾條潛在的EGFR信號傳導通路，包括：Ras/MAPK、PI3K、PLC-γ 和 STAT 四條主要的傳導通路[3-4]。

有絲分裂原激活蛋白激酶/細胞外信號調節(jié)激酶MAPK/ERKs（mitogenaetivated protein kinases/extracellular regulated kinases）信號傳導通路異常在食管癌增殖過度與凋亡受阻中起重要作用。ERKs可被多種絲裂原信號和癌基因產物激活，轉導信號至細胞及其核內，誘導細胞增殖和分化。Ras/MAPK通路是EGFR活化的一條重要信號轉導通路，ERK1/2一旦活化，便從胞質進入胞核，磷酸化和活化核內的效應分子，最終啟動與細胞增殖有關的靶基因的轉錄。研究表明，EGFR既介導促進細胞代謝、增殖、遷移，促進血管發(fā)生，抑制細胞凋亡的信號轉導通路的活化，又介導抑制細胞生長、促進凋亡的信號轉導通路的活化[5]。本研究檢測53例惠州客家人群食管癌EGFR蛋白及MAPK（ERK1/2）蛋白的表達，初步探討EGFR蛋白及MAPK（ERK1/2）與惠州客家人群食管癌發(fā)生發(fā)展的關系及其可能的與MAPK（ERK1/2）信號傳導相關的機制。

1 材料與方法

1.1 標本來源

53例食管鱗癌標本取自2004年1月～2008年12月惠州市中心人民醫(yī)院的食管癌患者53例 （三代以內為惠州本地客家人，術前均未經放療和化療）。根據(jù)2006年WHO組織學新分類進行分類，其中Ⅰ級13例，Ⅱ級19例，Ⅲ級21例；有淋巴結轉移21例，無淋巴結轉移32例；侵及淺層（黏膜下層或淺肌層）29例，侵及深層24例。同時取上述患者癌旁切緣組織作為對照組。

1.2 主要試劑

兔源 Anti-EGFR（1005）（Santa Cruz公司，美國），兔源Anti-MAPK（ERK1/2）及鼠源 Anti-p-ERK1/2（SIGMA 公司，美國），SP試劑盒（北京中山生物公司，中國）。

1.3 免疫組化染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫10 min，微波修復抗原后，滴加一抗：兔抗人EGFR （1∶200）；兔抗人MAPK（ERK1/2）（1∶500）；鼠抗 p-ERK1/2（1∶500）；均 4℃過夜。 次日滴加羊抗兔/鼠二抗，37℃30 min；DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明，封片。以PBS替代一抗作陰性對照。以含10%小牛血清1640培養(yǎng)的Hela細胞作為指標的陽性對照。采用HPIAS-1000高清晰度病理圖文分析系統(tǒng)，隨機觀察染色清晰的10個高倍視野共計數(shù)1 000個癌細胞陽性的百分比，將陽性細胞所占百分比打分：0分為陰性，1分為＜10%，2分為 10%～50%，3分為51%～75%，4分為＞75%。同時染色強度進行打分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。以兩者乘積為最后得分：0 分為陰性（-），1～2 分為弱陽性（+），＞3 分為陽性（++）。

1.4 Western blot免疫印跡法檢測蛋白表達

新鮮組織盡量剪碎（其中癌組織取實體瘤中心組織，癌旁正常組織僅取黏膜層），4℃ PBS沖洗，加入適量4℃ TritonX-100提取液以電動勻漿器勻漿（速度為11 000 r/min），其中癌組織勻漿1.5 min，癌旁正常黏膜勻漿4 min，玻璃勻漿器勻漿，每個組織勻漿20次再以超聲波破碎細胞（每個標本240次，頻率為間隔 2 s，超聲 2 s，功率為 300 W）；10 000 r/min 4℃離心5 min，取上清分裝后凍存于-80℃?zhèn)溆?。用Bradford法測定蛋白濃度。取100 μg蛋白點樣于10%SDS-PAGE，電泳分離蛋白質，電印跡半干轉移法轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉TBST溶液4℃冰箱封閉過夜，分別用一抗（EGFR工作效價 1∶500；ERK1/2 工作效價 1∶1000、p-ERK1/2 工作效價 1∶1000稀釋）與二抗孵育，DAB顯色或洗膜后ECL發(fā)光顯影，定影。硝酸纖維素膜經過洗脫去除二抗和一抗后，用β-actin抗體（作為內參）按上述同樣方法檢測。最后對膠片進行掃描，用Bio-Rad Quantity one軟件分析測定其區(qū)帶的灰度，并計算出與actin條帶灰度值的比值。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 11.0統(tǒng)計分析軟件，計數(shù)資料采用百分率表示，組間對比采用χ2檢驗。等級資料的相關性分析用非參數(shù)spearman等級相關檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EGFR蛋白在惠州客家人群食管癌組織及癌旁正常組織中的表達

免疫組化結果示：53例癌旁正常食管黏膜上皮（距腫瘤邊緣至少5 cm）僅見正常食管上皮基底細胞和間質細胞有低水平染色（+/-）（41例）和無 EGFR 表達（12例），基底層以上上皮細胞均呈EGFR陰性表達。53例食管癌組織中EGFR呈顯著過表達（37例呈陽性表達，陽性率為69.81%），高于癌旁正常組織（P＜0.01），陽性表達信號主要位于癌細胞的胞膜和胞漿（圖1、2）。實驗結果表明：①分化程度越低，EGFR表達越高，在Ⅰ～Ⅲ級食管鱗癌組織中，EGFR蛋白陽性率隨組織惡性程度增高而逐漸增加。②有淋巴結轉移患者EGFR的表達明顯高于無淋巴轉移者（P＜0.01）。見表1、2。Western blot顯示：食管癌及癌旁正常組織均表達EGFR，EGFR在食管癌組織中的表達遠高于在癌旁正常組織中的表達（P＜ 0.05）。 見圖 3。

圖1 EGFR在食管癌旁組織中的表達 HE×40

圖2 EGFR在食管癌組織中的表達HE×40

2.2 MAPK（ERK1/2）在惠州客家人群食管癌組織及癌旁正常組織中的表達

免疫組化顯示，MAPK（ERK1/2）蛋白陽性免疫產物呈棕黃色，廣泛分布于食管癌旁正常組織和食管癌細胞的胞漿內，少數(shù)可見核-漿表達。實驗結果表明：不同分級、浸潤深度及有無淋巴結轉移患者食管癌組織中ERK1/2表達差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。 （表 1、2）。 免疫組化及 Westernblotting結果（圖3）均顯示：食管癌及癌旁正常組織均表達ERK1/2蛋白，圖像分析和統(tǒng)計結果表明，ERK1/2在癌組織及癌旁正常組織中的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 p-ERK1/2在惠州客家人群食管癌及癌旁正常組織中的表達

免疫組化顯示：對p-ERK1/2的檢測表明：53例癌旁正常組織均呈p-ERK1/2陰性或弱陽性表達，陽性信號主要以基底細胞的胞核最強。53例食管癌組織中p-ERK1/2的表達顯著高于癌旁正常組織（P＜0.01），陽性信號位于癌細胞的細胞核（49例呈陽性，陽性率92.45%）（圖4、5）。實驗結果表明：①分化程度越低，p-ERK1/2表達越高，在Ⅰ～Ⅲ級食管鱗癌組織中，p-ERK1/2蛋白陽性率隨組織惡性程度增高而逐漸升高；②有淋巴轉移患者p-ERK1/2的表達明顯高于無淋巴轉移者（P＜0.01）。③浸潤淺肌層患者p-ERK1/2表達的陽性率明顯低于浸潤深肌層患者（P＜0.05）（表1、2）。Western blot結果顯示：癌組織強表達p-ERK1/2蛋白，相對于癌旁正常組織中的陰性或弱陽性表達有高度統(tǒng)計學意義 （P＜0.01）。見圖 3。

3 討論

EGFR/erbB1基因位于q7，為170～180 kDa的跨膜糖蛋白，由胞外配體結合區(qū)、跨膜區(qū)、胞內區(qū)（此區(qū)具有內在酪氨酸激酶活性）3部分組成。EGFR與其配體EGF等刺激信號結合后活化，啟動其信號傳導下游一系列的級聯(lián)反應，引起核內基因轉錄水平增加，促進細胞的增殖分化。EGFR在腫瘤細胞中過表達或突變，導致細胞生長失控和惡性轉化[4]。本實驗結果顯示：①癌旁正常食管黏膜上皮僅見正常食管上皮基底細胞和間質細胞有低水平染色（+/-），基底層以上的上皮細胞均呈EGFR陰性表達。②食管癌組織中EGFR呈明顯的過表達（陽性率為69.81%），陽性表達信號主要位于癌細胞的胞膜和胞漿。在惠州客家人群食管癌組織中EGFR蛋白存在過表達，癌組織分化程度及有無淋巴結轉移對其有影響，而癌浸潤深度對其無影響?？赡茉蚴谴嬖谥D錄后調控或蛋白質修飾的異常，或存在個體差異、地域性的食管癌組織可能存在表達差異，這種差異有待于進一步進行流行病學及分子生物學的研究來證實。

表1 EGFR、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白在食管癌及癌旁正常組織中的表達情況（例）

表2 EGFR、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白在不同病理特征食管癌患者中的表達情況（例）

圖3 Western blot結果顯示EGFR MAPK（ERK1/2）p-ERK1/2在惠州客家人群食管癌及癌旁正常組織中的表達

圖4 p-ERK1/2在食管癌旁組織中的表達（HE×400）

圖5 p-ERK1/2在食管癌組織中的表達（HE×400）

Raf→MEK （MAPkinase）→MAPK/ERK信號級聯(lián)是轉導細胞內信號的最重要通路。ERKs使細胞外接信號傳遞到細胞核內而調節(jié)基因表達等多種過程。研究表明，ERK在很多惡性上皮腫瘤中存在過度激活[5]。Iwase等[6]發(fā)現(xiàn)p-ERK在鼠胚胎胃組織中及人類胃癌組織中呈高表達，表明p-ERK可促進胃黏膜細胞的增殖及惡性轉化。Gu等[7]報道胃癌p-ERK蛋白表達明顯高于正常胃黏膜，并且p-ERK蛋白過表達與腫瘤浸潤深度，有無淋巴結轉移及臨床分期有關。本研究結果顯示：ERK1、ERK2蛋白表達水平在食管鱗癌組織與癌旁正常黏膜組織無差異（P＞ 0.05），而 p-ERK1、p-ERK2的表達水平卻顯著增高（P＜0.01），表明在惠州客家人群食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中ERK1/2蛋白被磷酸化活化為p-ERK而發(fā)揮作用?？梢?，ERK1/2在正常情況下以非活性形式存在，被磷酸化活化為p-ERK后，在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展等信號轉導途徑中起重要作用。

Leu 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子（epidermal growth fator，EGF）通過激活ERK1/2，上調凋亡抑制基因mcl-1表達而抑制食管癌細胞凋亡，說明ERK1/2過度活化與食管癌細胞增殖有關。持續(xù)活化的ERK1/2（P-ERK1/2）可激活周期調控基因CyclinD1和核轉錄因子c-myc，促使細胞由G1期向S期轉化，進而誘導細胞增殖[9]。因此，在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中，可能由于致癌因子或癌基因產物刺激，建立EGF/EGFR自分泌系統(tǒng)，使EGFR蛋白過表達，ERK1/2持續(xù)活化，而導致Ras/Raf/MEK/EKR信號通路的異常激活，細胞在轉錄水平增殖失控、凋亡受阻，使細胞發(fā)生惡性轉化，并促進腫瘤的浸潤和轉移。可見，在食管癌進展中EGFR/ERK信號級聯(lián)可能是食管癌的重要分子機制。但是，Barry等[10]研究發(fā)現(xiàn)在人食管胃惡性腫瘤轉移的肋骨骨髓細胞系p-ERK1/2顯著增多，MEK抑制劑PD98059和U0126不能阻滯ERK1/2活化，因而指出ERK1/2活化可能還有非Raf→MEK→MAPK/ERK機制，說明細胞內信號的轉導是復雜和多樣的，與腫瘤細胞增殖有關的ERK1/2活化是細胞內多條信號通路的匯聚點。

可見，ERK活化后從胞漿進入胞核是MAPK相關通路活化的重要組成部分，但是不能因此認為細胞核內有p-ERK的表達即認為ERK被活化。上述結果表明ERK通路的激活是食管癌發(fā)生的重要步驟，惠州客家人群食管癌中存在ERK的活化，p-ERK蛋白的表達與食管鱗癌的分化程度及癌細胞的浸潤行為有關，可見，EGFR蛋白可能通過啟動ERK1/2信號轉錄，在食管癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。可為食管癌抑制ERK通路的抗腫瘤藥物的靶向治療提供新的思路和線索。

[1]裴小娟，鄒冬梅，陶艷紅，等.惠州客家人群食管癌PTEN蛋白表達及與STAT1/3信號通路相關性的初步研究[J].中華腫瘤防治雜志，2009，16（12）：885-889.

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Preliminary study in Huizhou Hakka population of esophageal cancer EGFR protein expression and correlation with MAPK signaling pathway

PEI Xiaojuan1YANG Qingxu1ZOU Dongmei2ZHU Yingling1

1.Department of Pathology,Central People's Hospital of Huizhou City,Guangdong Province,Huizhou 516001,China；2.Chinese Medical Association Huizhou Dongjiang Pathology Diagnosis Center,Guangdong Province,Huizhou 516001,China

ObjectiveTo investigate the expression of EGFR protein in esophageal cancer of Huizhou Hakka population,discussing the relationship EGFR and MAPK activation of signal transduction in the occurrence and development of esophageal cancer of Huizhou Hakka population.MethodsImmunohistochemical staining and Western blot was employed to detect the expression of EGFR,MAPK and p-ERK1/2 protein expression in 53 cases of esophageal cancer and normal esophageal tissues adjacent to cancer.ResultsEGFR and p-ERK1/2 expression in esophageal cancer were significantly higher than in normal esophageal tissues adjacent to cancer(P<0.01);the lower the degree of differentiation,the higher expression of EGFR and p-ERK1/2;expression of EGFR and p-ERK1/2 with lymph node metastasis patients were higher than who without lymph node metastasis(P<0.01);positive expression rate of p-ERK1/2 with the superficial myometrial infiltration patients was remarkablely lower than that of depth of myometrial infiltration (P<0.05).ConclusionEGFR/MAPK signal transduction is closely related to the occurrence and development of esophageal cancer in Huizhou Hakka population.Accompanied by EGFR over expression,elevating the level of activated MAPK(ERK1/2)signaling pathway,so EGFR/ERK proteins may to provide a new target for early gene therapy in Huizhou Hakka population esophageal cancer.

Esophageal Carcinoma;Huizhou Hakka population;EGFR protein;MAPK protein;Signal transducation

R735.1

A

1673-7210（2012）08（c）-0016-04

廣東省科技計劃項目（2009B030801057）；惠州市科技計劃項目（2006Y001）。

裴小娟（1978-），女，碩士，主治醫(yī)師；主要從事臨床病理及分子病理工作。

楊清緒，主任醫(yī)師。

2012-03-01 本文編輯：郝明明）